Исследования аберраций
хромосом, индуцированных ионизирующими
излучениями, начавшиеся более
50 лет назад, позволили установить
зависимость их образования от
стадии митотического цикла, на
которую приходится мутагенное
воздействие. При облучении клеток
растений и животных в фазе
G1 хромосома ведет себя как
одна эффективная нить. Это значит,
что единицей разрыва и обмена,
являющихся цитогенетическими эффектами
радиации, служит целая хромосома.
Согласно унинемной модели, это
утверждение равносильно тому, что
единицей разрыва и обмена
в конечном итоге служит одна
молекула ДНК. Перестройки хромосом,
образующиеся при облучении в
фазе G1, называются аберрациями хромосомного
типа.
Иная картина наблюдается
при действии ионизирующих излучений
на клетки в постсинтетическом
периоде (G2). Здесь каждая хромосома
представлена двумя хроматидами
и каждая из хроматид выступает
как независимая единица разрыва
и обмена. Поэтому в фазе G2 хромосома
реагирует на облучение как
структура, состоящая из двух
эффективных нитей, а перестройки,
возникающие в этой фазе, называются
аберрациями хроматидного типа.
Казалось бы, в фазе
синтеза ДНК в ответ на действие
радиации должны формироваться
как хромосомные (в еще не
реплицировавшихся участках) аберрации,
так и перестройки хроматидного
типа (в участках хромосом, где
прошла репликация). Было, однако, показано,
что смена типа перестроек
с хромосомного на хроматидный
в действительности происходит
за 1-2 ч до начала фазы S. Причины
этого явления до конца не
ясны.
При облучении клеток
в конце фазы G2 - начале профазы
образуются перестройки своеобразной
конфигурации, получившие название
субхроматидных обменов, поскольку
нить, соединяющая две расходящиеся
в анафазе дочерние хромосомы
(бывшие сестринские хроматиды),
тоньше хроматиды. Установить
истинную природу той или иной
перестройки можно путем анализа
ее репродукции в полиплоидизирующихся
клетках, например в клетках
высших растений, в которых веретено
разрушено колхицином. Обычно в
тетраплоидах наблюдается удвоение
аберраций, индуцированных радиацией
в диплоидных клетках. При этом
хроматидные перестройки, в частности
изохроматидные и межхромосомные
асимметричные хроматидные обмены,
превращаются в типичные аберрации
хромосомного типа. Точно так
же ведут себя и субхроматидные
обмены. На этом основании Б.Н.
Сидоров и Н.Н. Соколов (1964) высказали
мысль, что субхроматидные обмены
в действительности представляют
собой хроматидные перестройки,
морфологически незавершенные (т.е. в них
не обособились фрагменты) вследствие
компактизации хромосом в профазе.
Таким образом, для
радиационного хромосомного мутагенеза
характерно возникновение структурных
мутаций в той стадии митотического
цикла, на которой произошло
облучение.
В отличие от радиации
химические мутагены типа алкилирующих
соединений не вызывают хромосомных
аберраций в фазе G1, хроматидных
- в G2 и субхроматидных - в G2-профазе.
Обязательное условие формирования
аберраций, индуцированных алкилирующими
агентами - репликация ДНК в поврежденных
участках хромосом. Поэтому при
действии алкилирующих соединений
на синтетическую фазу цикла,
образуются хроматидные аберрации.
Если же эти мутагены повреждают
клетки в фазе G2, то аберрации
хроматидного типа формируются
в следующем митозе.
Детальный анализ механизмов
мутагенеза этого типа, значительный
вклад в изучение которого
внесли советские генетики Н.П.
Дубинин, Н.В. Лучник, Б.Н. Сидоров,
Н.Н. Соколов, Н.И. Шапиро и
др., позволили заключить, что
процесс образования хромосомных
аберраций складывается из нескольких
этапов. Первый - первичное репарируемое
молекулярное повреждение ДНК,
возникающее под действием непосредственно
мутагенного фактора либо его
продуктов в клетке, например, при
облучении свободных радикалов.
Конечный этап - образование видимых
под микроскопом разрывов и
обменов хромосом.
В последние годы
находит подтверждение высказанная
независимо в конце 20-х гг. Дж.
Беллингом и А.С. Серебровским
мысль о том, что мишенями
для формирования аберраций хромосом
служат участки физиологических,
т.е. нормально возникающих в
клетке, межхромосомных и внутрихромосомных
контактов. Частными случаями
таких контактов являются петли,
предшествующие образованию делеций,
инверсий и кольцевых хромосом.
Контакты на молекулярном уровне
могут представлять собой взаимодействия
повторяющихся нуклеотидных последовательностей,
принадлежащих к одному семейству.
В заключение остановимся
на превращении кольцевых хромосом,
доля которых при некоторых
мутагенных воздействиях, например
при облучении клеток растений
и млекопитающих в фазе G1, довольно
значительна. Судьба кольцевых
хромосом, как центрических, так
и ацентрических, зависит от
сестринских хроматидных обменов
(СХО), регулярно осуществляющихся
в фазах S и G2. Если СХО между
палочковидными, обычными хромосомами
не изменяют их форму, то
аналогичный процесс между кольцевыми
хромосомами может иметь различные
последствия. В результате СХО
кольцевые хромосомы могут превращаться
в дицентрические кольца и
палочковидные хромосомы, причем
разрывы колец в последнем
случае будут распределены по
хромосоме случайно. Следовательно, в
таких клетках при каждом разрыве кольца
разные гены будут занимать положение,
ближайшее к точке разрыва, и испытывать
эффект положения.
Различия в чувствительности
к радиации регистрируется не
только на уровне организмов,
но и отдельных типов клеток.
Так, сперматозоиды дрозофилы
намного чувствительней к мутагенному
действию рентгеновских лучей,
чем сперматогонии и особенно
ооциты. Больше всего мутаций
индуцируется в дробящихся яйцах.
Эти различия, отмеченные и для
многих других организмов, могут
быть связаны с особенностями
состояния ДНК (степень спирализации
хромосом, плотность их упаковки
в ядре и др.) и митотической
активности клеток разных типов
с неодинаковым содержанием воды
в их протоплазме, влияющим
на возникновение свободных радикалов
и перекисей, с различиями в
их репарационной способности.
Таким образом, индуцируемый
радиацией мутагенез зависит
от следующего: 1) дозы и характера
облучения; 2) особенностей организма;
3) типа облученных клеток; 4) условий
среды в момент облучения и
после него; 5) физических особенностей
разных видов ионизирующих облучений;
6) типа повреждений ДНК и 7)
эффективности систем их репарации.
Несмотря на обилие
данных, молекулярный механизм радиационного
мутагенеза не вполне ясен. Известно,
однако, что рентгеновское облучение
приводит к разрыву водородных
связей в двойной спирали ДНК,
одно- и двухцепочечным разрывам
ДНК, сшивкам между двумя цепями
ДНК, между различными молекулами
ДНК и между ДНК и белком.
Двойные разрывы ДНК у прокариот
преимущественно летальны. Недавние
исследования, главным образом на
E. coli, выявили три механизма репарации
одноцепочечных разрывов, вызванных
ионизирующим излучением. Различия
между ними определяются временем,
необходимым для устранения повреждения,
которое колеблется в зависимости
от типа репарации и условий
среды обитания облученных клеток
от 2 до 60 мин. Имеются данные и
о возможности репарации разрывов
обеих цепей ДНК, в осуществлении
которой, как показано С.В. Шестаковым
с сотрудниками, участвуют рекомбинационные
механизмы.
Мутагенное действие ультрафиолетовых
лучей
Способность ультрафиолетовых
(УФ) лучей вызывать мутации была
обнаружена в начале 30-х годов
в исследованиях на дрозофиле
и цветковых растениях. В отличие
от рентгеновских, УФ-лучи не обладают
достаточной энергией для индукции
ионизации атомов. Однако они поглощаются
входящими в состав ДНК пуринами
и пиримидинами, переводя их в возбужденное
состояние. Экспериментальная работа
с УФ-лучами связана с определенными
трудностями, поскольку они слабо
проникают внутрь тканей у многоклеточных
организмов, задерживаясь в поверхностных
слоях клеток. Тем не менее, УФ-лучи довольно
сильный физический мутаген, особенно
для одноклеточных организмов. ДНК максимально
адсорбирует УФ-лучи с длиной волны 254
нм. Эта же величина соответствует максимуму
мутагенности УФ-лучей, что указывает
на прямую связь процесса индукции предмутационных
повреждений ДНК с поглощением УФ-лучей
ее азотистыми основаниями.
Подобно большинству
мутагенов, УФ-лучи индуцируют
в ДНК не мутации, а только
предмутационные повреждения. Для
того чтобы такие повреждения
преобразовались в мутации, они
должны закрепиться, или фиксироваться,
т.е. привести к определенному
изменению последовательностей
оснований в ДНК. В результате
поглощения УФ-лучей с длиной
волны 254 нм наиболее реактивными
становятся пиримидины, в ответ
на облучение образующие два
типа фотопродуктов - гидраты
и димеры. Основные продукты при
облучении двухцепочечной ДНК
- пиримидин-пиримидиновые, преимущественно
тимин-тиминовые димеры, формирующие
между соседними основаниями
в цепи ДНК циклобутановое
кольцо. Такие димеры рассматриваются
как предмутационные повреждения,
индуцированные УФ-лучами. Их разрушение
в результате фотореактивации
устраняет до 90% случаев мутагенеза,
связанного с включением ошибочного
основания против поврежденного
участка. Присутствие димеров
в ДНК приводит к ошибкам
при ее репликации. Наряду с
этим осуществляющееся в ходе
репликации УФ-повреждений вырезание
димеров из ДНК и восстановление
целостности ее структуры также
может привести к ошибкам. Сравнительно
недавно обнаружен еще один
тип повреждений ДНК, индуцированных
УФ-лучами, - пиримидин-пиримидин (6-4)
УФ-фотопродукты. Они образуются
в форме димеров между тимином
и цитозином в УФ-облученной
ДНК в количестве 1/10 от общего
числа димеров пиримидина, однако
скорость их формирования в
определенных последовательностях
ДНК выше, чем циклобутановых
димеров. Такие последовательности
являются одновременно “горячими
точками” образования (6-4) УФ-фотопродуктов
и индуцированных УФ-лучами замен
пар оснований типа транзиций,
ведущих к появлению амбер
(УАГ)-, охра (УАА)- и опал (УГА)-кодонов
в соответствующем участке иРНК.
Отсюда сделано заключение, что
(6-4) УФ-фотопродукты наряду с димерами
пиримидинов представляют собой
один из типов предмутационных
повреждений, индуцируемых в ДНК
УФ-лучами.
Мутагенное действие химических
соединений
Химический мутагенез
был открыт в 30-х годах работами
В.В. Сахарова, М.Е. Лобашева и др., обнаруживших,
что некоторые соединения (йод, марганцевокислый
калий, аммиак, уксусная кислота, сульфат
меди) способны индуцировать летальные
мутации у дрозофилы. В 1939 г. С.М. Гершензон
установил, что добавление ДНК из
тимуса теленка в корм личинок
дрозофил индуцирует у них видимые
мутации. Широкое изучение химического
мутагенеза началось после того, как
в 1946 г. И.А. Рапопорт (в СССР) обнаружил
мощное мутагенное действие этиленамина
и формальдегида, а Ш. Ауэрбах (в
Англии) - иприта и его производных.
С тех пор было выявлено много
химических соединений, которые по
своей мутагенной активности могут
быть разделены на два класса: 1) соединения,
мутагенные в отношении как реплицирующейся,
так и нереплицирующейся (покоящейся)
ДНК: алкилирующие соединения, гидроксиламин
и азотистая кислота; 2) соединения,
мутагенные только в отношении реплицирующейся
ДНК: аналоги оснований, структурно
напоминающие нормальные пурины и пиримидины
в ДНК, а также акридиновые красители.
Рассмотрим вкратце
механизм и особенности мутагенного
действия некоторых из этих
соединений.
Мутагены, действующие на
покоящуюся и реплицирующуюся ДНК
Алкилирующие агенты. Известны
9 классов алкилирующих агентов, различающихся
по типу алкильных групп (СН3-метильной,
С2Н5-этильной и более сложных), которые
они переносят на биологически важные
макромолекулы, включая ДНК, и по
числу алкильных групп, которые
может отдавать одна молекула алкилирующего
агента. Последнее свойство характеризует
функциональность соединения, причем
“полифункциональными” называют все
алкилирующие агенты, у которых число
алкильных групп больше единицы.
Степень функциональности определяется
особенностями соединения, а не только
числом алкильных групп. Так, несущий
две метильные группы метилметансульфонат
СН3ОSOСН3, способен отдавать только одну
из них, поэтому относится к монофункциональным.
Механизм мутагенного
и летального действия многих
алкилирующих агентов не вполне
ясен. Известно, однако, что при действии
соединений из группы нитрозоалкиламинов
(нитрозонитроалкилгуанидина, алкилнитрозомочевины)
основным предмутационным изменением
в ДНК является образование
О6-алкилгуанина, а гибель клеток
вызывается преимущественно образованием
3-алкиладенина и 3-алкилгуанина.
Вместе с тем наиболее часто
алкилированию подвергается атом
азота в 7-ом положении гуанина.
Например, 98% всех повреждений ДНК,
индуцированных метилметансульфонатом,
составляют метилированные основания,
среди которых на долю N7-мелтилгуанина
приходится 84%. Тем не менее мутагенный
эффект этого алкилирующего агента
непосредственно не связан с
присутствием в ДНК модифицированных
оснований, а обусловлен индукцией
системы ошибающейся репарации
ДНК.
Главное следствие
мутагенного действия алкилирующих
агентов - появление мутаций типа
транзиций ГЦ?АТ. Кроме того, в
результате ошибок репарации
могут возникать мутации типа
транзиций АТ?ГЦ, трансверсий и
сдвига рамки считывания. Некоторые,
особенно бифункциональные алкилирующие
агенты, например азотистый иприт
или антибиотик митомицин С,
вызывают поперечные сшивки цепей
молекул ДНК, приводящие к разрывам
хромосом и, как следствие,
к хромосомным аберрациям.
Мутагенное действие
некоторых нитрозосоединений (диэтилнитрозомочевины,
нитрозометил- и нитрозоэтилмочевины
и др.) столь значительно, что
общая частота вызываемых ими
мутаций может достигать 100%. Из
этих соединений часто используется
N-метил-N/-нитро-N-нитрозогуанидин (сокращенно
нитрозогуанидин), способный индуцировать
мутации в участках хромосомы
E. coli, которые в момент обработки
мутагеном находятся в репликативной
вилке. На дрозофиле же этот
мутаген вызывает генные мутации
и перестройки в сперматозоидах,
в которых репликации ДНК не
происходит. Нитрозоалкилмочевины
нашли широкое применение в
селекции растений.