Вначале в немутантном
гене в результате прямого
или непрямого воздействия мутагена
на ДНК возникает изменение,
рассматриваемое как предмутационное
(например, димер тимина и цитозина
или алкилированное основание). Такое
изменение может оказаться летальным
или подвергнуться репарации.
Это, в свою очередь, может
восстановить нормальный ген
либо привести к фиксации предмутационного
повреждения и возникновению
мутантного гена и соответственно
мутантной клетки. В том случае,
если клетка не гибнет, а сохраняет
жизнеспособность, ее размножение
ведет к образованию мутантного
клона.
Тип мутаций определяет
относительную специфичность этого
процесса. В случае генных мутаций
специфичность, как следует из
приведенных в этом разделе
примеров, проявляется в существовании
“горячих точек” индуцированной
мутабильности, характер распределения
которых зависит от двух факторов
- последовательности нуклеотидов
в данном гене и использованного
мутагена. Вырожденность генетического
кода обусловливает возможность
замены нуклеотидов в третьем
положении кодона без замен
аминокислот в полипептидной
цепи. Наряду с этим появление
новой аминокислоты в результате мутации
может не отразиться на активности фермента.
Несомненно, от особенностей реакции мутагена
с теми или иными нуклеотидами или последовательностью
нуклеотидов зависит, какие участки гена
будут оставаться “холодными”, т.е. не
претерпевать изменений, а какие - “горячими”,
т.е. мутировать часто. В силу двух первых
причин даже мутации в “горячих точках”
могут быть “молчащими”, если они не проявляются
фенотипически. С этим, в частности, связано
то, что истинная частота мутаций в данном
гене всегда выше частоты появления мутантов
по контролируемому им признаку.
Специфичность мутагенеза
в отношении типа возникающих
хромосомных мутаций оценивается
по частоте образования внутренних
делеций, концевых нехваток, инверсий,
дупликаций и транслокаций. Вместе
с тем специфичность действия
мутагена определяется и рядом
других факторов, значимость которых
зависит от типа мутагена, особенностей
клеточных процессов, влияния
окружающей среды. К ним относятся:
влияние внехромосомных компонентов
клетки (ядерной оболочки, хромосомного
белка) на проникновение мутагена;
локальные различия в структуре
хромосом, облегчающие проникновение
мутагенов к одним генам по
сравнению с другими; характер
репарации предмутационного повреждения,
определяющий его дальнейшую
судьбу; зависимость проявления
мутаций от изменений структурных
компонентов клетки (например, мембран
или рибосом), особенностей генотипа
клетки (например, наличие генов-мутаторов
или антимутаторов); возможности
для образования мутантного клона,
в значительной степени зависимые
от окружающей среды.
Проблема мутагенной
специфичности лежит в основе
представлений о направленном
и ненаправленном мутагенезе. Стремление
к индукции направленных мутаций,
открывающих неограниченные возможности
для переделки живой природы,
определяло поиски мутагенов,
способных специфично воздействовать
на тот или иной ген и
вызывать мутации по вызываемому
признаку. Ни один из известных
теперь мутагенов такой избирательной
специфичностью не обладает. В
какой-то мере исключение из
этого общего правила составляет
нитрозогуанидин, с помощью которого
удается провести локализованный
мутагенез у бактерий. Как отмечалось,
этот мутаген вызывает у бактерий
множественные мутации, возникающие
преимущественно в зоне репликативной
вилки. Поэтому среди обработанных
нитрозогуанидином клеток можно
отбирать особи, несущие мутацию
в заданном районе хромосомы.
Если такая мутация приводит
к устойчивости к антибиотикам
либо к реверсии к прототрофности,
то клоны бактерий, обладающих
мутантным фенотипом, легко отбирать
на соответствующих селективных
средах. При этом в отобранных
мутантных штаммах часто обнаруживаются
и дополнительные мутации в
сцепленных генах.
Существенные сдвиги
в решении проблемы направленного
мутагенеза произошли в последние
годы в связи с разработкой
методов манипулирования с изолированными
ДНК. Появилась возможность подвергать
мутагенной обработке не весь геном in
vivo, а его определенные фрагменты in vitro.
Методы клонирования генов позволяют
направленно получать мутации даже при
использовании обычно неспецифических
мутагенов, например гидроксиламина и
его производных. С помощью химически
синтезированных олигонуклеотидов можно
конструировать мутантные гены, содержащие
небольшие вставки, делеции либо желаемые
замены нуклеотидов. Таким путем были
получены мутантные гены, кодирующие синтез
белков некоторых бактериофагов, тРНК
у дрожжей и др.
Эти и другие методы
создали широкие возможности
для изучения различных структурных
генов и регуляторных участков
ДНК, исследования связи между
определенной заменой аминокислот
и нарушением их функции и
для получения мутантных белков.
Задача ближайшего будущего - использование
методов направленной индукции
мутаций для создания организмов
с желаемыми признаками. Успех
в решении этой важной в
практическом отношении проблемы
связан с будущим углубленным
изучением генетического аппарата
животных и растений на молекулярном
уровне.
Мутагенез и репарация
ДНК
Различают три основные возможности
формирования предмутационных повреждений
ДНК и возникновения мутаций.
Во-первых, мутаген может включиться
в ДНК вместо нормального основания.
Так, 2-аминопурин, являющийся аналогом
аденина, встраиваясь в ДНК, спаривается
с тимином либо цитозином, что
приводит к возникновению транзиций
типа АТ?ГЦ и ГЦ?АТ. Во-вторых, мутаген
может сам не встраиваться в ДНК,
но так модифицировать основания, что
в ходе последующей репликации произойдет
их ошибочное спаривание. Примеры
мутагенов с подобной активностью
- гидроксиламин, модифицирующий цитозин,
и азотистая кислота, дезаминирующая
аденин и цитозин, превращающиеся соответственно
в гипоксантин и урацил. Близкий
механизм мутагенного действия имеют
и алкилирующие агенты - этилметансульфонат
и нитрозогуанидин. Основное предмутационное
повреждение, вызываемое этими мутагенами,-
модификация гуанина с образованием
О6-алкилгуанина. При отсутствии репарации
последний обусловливает ошибочное
спаривание с тимином, в результате
которого возникают транзиции ГЦ?АТ.
В-третьих, мутаген может повредить
одно или несколько оснований, затрудняя
или делая невозможным их спаривание
с обычными основаниями. Примеры
таких повреждений - димеры тимина и
другие УФ-фотопродукты, подавляющие
нормальную репликацию ДНК, для восстановления
которой требуется индукция особого
типа репарации ДНК, называемой SOS-репарацией.
Именно этот тип репарации наиболее
тесно связан с возникновением мутаций.
Большинство индуцированных
физическими и химическими факторами
повреждений ДНК, потенциально
являющихся источниками мутаций,
исправляются с помощью нескольких
механизмов репарации, направленных
на восстановление целостности
структуры ДНК и тем самым
на сохранение стабильности генетического
материала в ряду поколений.
Все известные в
настоящее время способы репарации
ДНК обеспечиваются конститутивными,
т.е. постоянно действующими, либо
индуцированными ферментами, удаляющими
повреждения, возникшие в одной
из цепей ДНК. При этом некоторые
способы могут не вполне точно
восстанавливать исходную последовательность
оснований в ДНК, вследствие
чего возникают мутации.
Наиболее подробно
исследована репарация ДНК в
УФ-облученных клетках, поэтому
большинство рассматриваемых ниже
факторов относятся к репарации
повреждений, индуцированных УФ-лучами.
Возможность репарации
ДНК была обнаружена в 1949 г.,
когда три автора - А. Кельнер,
Р. Дюльбекко и И.Ф. Ковалев
независимо установили, что освещение
видимым светом (с длиной волны
свыше 400 нм) актиномицетов, бактериофага
и парамеций восстанавливает
их жизнеспособность после УФ-облучения
в летальных дозах. Это явление
названо фотореактивацией. В 1964 г.
Р. Сетлоу и У. Керриер, Р.
Бойс и П. Говард-Фландерс также
независимо друг от друга обнаружили
процесс темновой репарации ДНК,
т.е. возможность удаления летальных
УФ-повреждений в отсутствие обработки
клеток после УФ-облучения видимым
светом. Феномен обратимости повреждений,
вызванных ионизирующим облучением,
в клетках дрожжей и растений,
впервые обнаружили в конце
50-х годов В.И. Корогодин и
Н.В. Лучник. Основные механизмы
репарации ДНК и ферменты, обеспечивающие
этот процесс, были раскрыты
к концу 70-х годов. В это
же время исследования репарации
ДНК стали широко проводиться
на млекопитающих, хотя основным
объектом для выяснения ее
механизмов остаются микроорганизмы.
Применение в самое последнее
время различных методов работы
с рекомбинантными ДНК и техники
определения нуклеотидных последовательностей
(секвенирования) ДНК существенно
расширили возможности изучения
молекулярных механизмов ее репарации.
У E. coli, а затем и у дрожжей
Sacharomyces cerevisiae, были клонированы и
секвенированы многие гены, отвечающие
за репарацию ДНК. У E. coli идентифицировано
свыше 50 таких генов. Большинство
генов, вовлеченных в репарацию
ДНК у E. coli, обнаружены и у
другой энтеробактерии - Salmonella typhimurium.
У S. cerevisiae описано несколько десятков
мутаций в генах, контролирующих
чувствительность клеток к излучениям
и химическим мутагенам.
Различают три основных
типа репарации ДНК. Первый - дорепликативная
репарация, называемая также внерепликативной,
включает фотореактивацию и различные
формы темновой эксцизионной
репарации, направленной на вырезание
(эксцизию) участков ДНК, несущих
повреждения. Второй - пострепликативная,
или внутрирепликативная, репарация
- осуществляется с помощью механизмов,
участвующих в процессах рекомбинации
и репликации ДНК, и обеспечивает
восстановление интактности ДНК,
содержащей небольшое число повреждений,
не удаленных в ходе репарации первого
типа. Оба типа репарации ДНК устраняют
основную часть предмутационных повреждений.
Напротив, третий тип - индуцируемая репарация
ДНК, зависимая у бактерий от функционирования
генов recA и lexA, - является основным источником
ошибок, приводящих к возникновению мутаций.
Этот тип репарации относят к группе так
называемых SOS-ответов клетки, индуцируемых
повреждениями ее ДНК. Существование различных
форм репарации повреждений ДНК доказано
в отношении как про-, так и эукариот, однако
наиболее детально эти процессы изучены
у E. coli.
Дорепликативная репарация
Наибольшее количество летальных
для клетки повреждений ДНК устраняется
до ее репликации с помощью нескольких
процессов, которые могут идти одноэтапно
или многоэтапно. Примеры одноэтапного
процесса, осуществляющегося с помощью
одного фермента: 1) фотореактивация; 2)
обнаруженное в клетках млекопитающих
прямое встраивание пуринов в
апуриновые сайты ДНК с помощью
особого фермента, называемого пурин-инсертазой;
3) репарация после действия простых
алкилирующих агентов путем отщепления
алкильных групп от О6-метил- и
О6-алкилгуанина, являющаяся одним из
звеньев адаптивного ответа клетки
на действие сверхмалых доз указанных
агентов; 4) воссоединение однонитевых
разрывов ДНК при 3?-ОН и 5?-РО4 концевых
разрывах, разделенных лишь одним
нуклеотидом. Эту реакцию катализирует
ДНК-лигаза. К многоэтапным процессам
дорепликативной репарации относят
два типа темновой эксцизионной репарации.
Один из них удаляет основание, другой
- нуклеотиды. К многоэтапным процессам
дорепликативной репарации ДНК
относится уже упоминавшаяся
репарация одно- и двухцепочечных
разрывов, индуцированных ионизирующей
радиации (рентгеновскими и ?-лучами), а
также репарация ДНК, содержащей
поперечные сшивки, обусловленные действием
таких соединений, как митомицин
С или псорален.
Фотореактивация
Фотореактивирующее действие
видимого света связано с активностью
фермента дезоксириботидпиримидинфотолиазы,
специфично связывающейся с УФ-облученной
ДНК и расщепляющей на мономеры основные
УФ-фотопродукты - димеры двух соседних
пиримидинов в одной цепи ДНК,
объединенных циклобутановым кольцом.
Фермент присоединяется к пиримидиновым
димерам в ДНК в темноте, но
реакция расщепления связей, объединяющих
две молекулы пиримидина, энергетически
зависима от видимого света. Особенно
эффективен свет, лежащий в голубой
части спектра. Подсчитано, что за
1 мин молекула фотолиазы может
расщепить 2,4 димера. Фотолиазы, различающиеся
по своим размерам (Мr 35 000-50 000), обнаружены
у E. coli, некоторых дрожжей, в лимфоцитах
человека. Все они относятся к
ферментам типа флавопротеинов. В
облученных клетках E. coli фотореактивация
удаляет до 90% пиримидиновых димеров,
что повышает выживаемость клеток и значительно
снижает частоту мутаций. Однако есть
данные о том, что эффективность удаления
предмутационных повреждений в ходе фотореактивации
зависит от типа повреждения. Так, при
исследовании УФ-индуцированных мутаций
в контролирующем образование аденина
гене ad-3 у дрожжей и в rII области фага Т4
было показано, что фотореактивация не
снижает числа мутаций с заменой оснований
или со сдвигом рамки. Это свидетельствует
о том, что димеры тимина не единственные
факторы УФ-мутабильности и что в образовании
УФ-индуцированных мутаций участвуют
и другие фотопродукты. Подтверждением
тому служат данные, показывающие, что
(6-4) УФ-фотопродукты цитозина фотореактивации
не подвергаются.
Темновая эксцизионная репарация
В отличие от фотореактивации
другие пути репарации повреждений
ДНК не нуждаются в энергии
видимого света и поэтому относятся
к темновой репарации.
Гипотеза о существовании
темновой репарации повреждений,
индуцированных УФ-лучами, была высказана
в 1961 г. Э. Виткин и М. Либ
на основе анализа двух взаимосвязанных
явлений, обнаруженных при изучении
мутагенеза у бактерий: фиксации
мутаций и снижения частоты
мутаций. Оба они касаются фактов
замедленного проявления мутагенного
действия УФ-лучей. Эта особенность
наблюдалась еще в 30-х годах
Л. Стадлером при анализе спектра
индуцированных УФ-лучами генетических
изменений у растений. Л. Стадлер
построил модель действия УФ-лучей,
в соответствии с которой повреждения
хромосомы в виде ее разрыва
или мутации - не одномоментный
акт, а растянутый во времени
процесс, в ходе которого фиксируются
потенциальные мутационные повреждения.
Такое отсроченное возникновение
мутаций у бактерий выражено
еще сильнее, чем у растений.
Замедленный мутационный ответ
характерен и для химического
мутагенеза, особенно для действия
алкилирующих агентов.
Анализ природы замедленных
мутаций, индуцированных у E. coli
УФ-лучами, проведенный Э. Виткин
(1956) и Ч. Дадней с Ф. Хаасом
(1958), показал, что реализация предмутационных
повреждений или же их утрата
зависят от того, на какой среде
(обогащенной или бедной, лишенной
необходимых для роста аминокислот)
будут выращиваться бактерии
в течение первых 1-1,5 ч после
облучения. Оказалось, что инкубация
облученных клеток в обогащенной
среде обеспечивала высокую частоту
мутаций независимо от того, в
какой среде (богатой или бедной)
велась последующая инкубация.
Напротив, если вначале облученные
бактерии 1-1,5 ч выдерживали в бедной
(минимальной) среде, частота мутаций
была низкой независимо от
условий дальнейшей инкубации.
Процесс постепенной утраты потенциальных
мутаций из-за дефицита аминокислот
в бедной среде был назван
снижением частоты мутаций.
Восстановление нормальной
структуры ДНК, содержащей не
свойственные ей или модифицированные
основания, обеспечивается эксцизионной
репарацией. Процесс начинается
с действия ферментов ДНК-гликозилаз,
катализирующих гидролиз N-гликозидных
связей между азотистым основанием
и дезоксирибозой. ДНК-гликозилазы
эффективно удаляют поврежденные
либо не свойственные ДНК основания,
появившиеся в ней спонтанно
либо под действием УФ-, рентгеновских
лучей, разнообразных алкилирующих
агентов. В зависимости от типа
оснований, в отношении которых
проявляется активность этих
ферментов, различают урацил-, гипоксантин-,
3-метиладенин-, 7-метилгуанин- и другие
ДНК-гликозилазы. В результате
удаления не свойственных ДНК
(например, урацила) или модифицированных
(например, гипоксантина, 3-метиладенина
и др.) оснований, осуществляющегося
без разрыва сахарофосфатного
каркаса ДНК, образуются апуриновые
или апиримидиновые сайты (АП-сайты),
служащие, в свою очередь, субстратом
действия еще одной группы
ферментов, называемых АП-эндонуклеазами.
Сочетанное действие ДНК-гликозилазы
и АП-эндонуклеазы приводит к
вырезанию АП-сайтов в составе
олигонуклеотидов. На первом этапе
в результате спонтанной потери
оснований либо под действием
ДНК-гликозилазы в полинуклеотидной
цепи появляется АП-сайт. Далее
этот сайт атакуется 3?-АП-эндонуклеазой,
вызывающей гидролиз фосфодиэфирных
связей на 5?-конце к АП-сайту,
в результате чего освобождается
3?-ОН конец. На следующем этапе
олигонуклеотид, содержащий дезоксирибозофосфатный
остаток, вырезается ферментом
5?-АП-эндонуклеазой. Наконец, на
последнем этапе образовавшаяся
брешь закрывается в ходе репаративного
синтеза, осуществляемого ДНК-полимеразой
I, а ковалентные связи полинуклеотидной
цепи восстанавливаются ДНК-лигазой.