В механизме разрывов
цепи ДНК под действием алкилирующих
агентов важная роль принадлежит
процессу возникновения “апуриновых
брешей”, возникающих вследствие
ослабления связей между алкилированным
гуанином либо (реже) аденином и
сахарофосфатным остовом, ведущего
к постепенному выпадению пурина
из алкилированной ДНК. На место
выпавшего пурина в образовавшийся
апуриновый сайт может встроиться
какое-либо другое основание,
что ведет к возникновению
генной мутации.
Отмечено сходство
генетических эффектов между
алкилирующими агентами и рентгеновскими
лучами. Поэтому иприт и близкие
к нему соединения иногда называют
“радиомиметиками” (от греч. “mimetes”-подражатель).
Действительно, многие алкилирующие
агенты, как и рентгеновские лучи,
вызывают доминантные, сцепленные
с полом летали и видимые
мутации, крупные и мелкие делеции,
инверсии и транслокации. Подобно
рентгеновским лучам, химические
радиомиметики способны индуцировать
кроссинговер в соматических
и половых клетках.
Доказательства существования
замедленного мутагенеза и нестабильности,
связанных с действием алкилирующих
агентов, были получены при
анализе мозаичных мутантов у
дрозофилы и дрожжей. У таких
мутантов часть клеток является
мутантной по определенному признаку,
а другая часть сохраняет по
тому же признаку дикий фенотип.
Способность вызывать мозаичные
мутации присуща всем мутагенам,
как физическим, так и химическим.
Образование мозаик непосредственно
связано с молекулярным механизмом
индуцированного мутагенеза. Известно,
что в каждом данном сайте
предмутационные изменения затрагивают
одну или обе цепи дуплекса
ДНК. Фиксация таких потенциальных
мутационных повреждений связана
с репликацией. При репликации
ошибка в одной цепи ДНК
ведет к формированию мутагенного
клона, тогда как другая, нормальная,
цепь обеспечивает правильный
матричный синтез комплементарной
цепи и образование клона дикого
типа. Как же в таком случае
можно объяснить факт образования
полных мутаций? Для объяснения
этого явления предложена репарационная
гипотеза, согласно которой в
клетках имеется какой-то фермент,
способный удалить ошибочное
основание до первой репликации,
т.е. до момента фиксации мутации. В зависимости
от того, какая из цепей ДНК подвергается
коррекции в ходе последующего репаративного
ресинтеза, а затем и вегетативной репликации,
возникнут чистые клоны мутантного или
дикого типа. При отсутствии коррекции
появится смешанный клон. Известно, однако,
что репаративные ферменты могут различать
поврежденную и интактную цепи ДНК.
Гидроксиламин. В отличие
от большинства алкилирующих
агентов гидроксилирующий агент
гидроксиламин NH2OH обладает строго
специфичным мутагенным действием.
Он индуцирует преимущественно
транзиции ГЦ?АТ. Механизм мутагенности
гидроксиламина не вполне ясен,
однако известно, что он предпочтительно
взаимодействует с цитозином,
присоединяя к нему аминогруппу.
Такой модифицированный цитозин
способен ошибочно спариваться
с аденином, что и ведет к
образованию транзиции ГЦ?АТ. Ввиду
своей специфичности гидроксиламин
часто используется для определения
типа транзиции, вызванной другими
мутагенами. Например, мутанты, возникшие
в результате транзиций, могут
быть разделены на два класса
в зависимости от способности
ревертировать под действием
гидроксиламина. Очевидно, те из
них, которые содержат в мутантном
сайте пару АТ, не ревертируют.
Напротив, если мутация привела
к замене оснований типа АТ?ГЦ,
то она будет ревертировать.
Поскольку гидроксиламин
способен действовать на покоящуюся
ДНК, он эффективно используется
в качестве агента индуцирующего
in vitro мутации в трансформирующей
ДНК бактерий либо у внеклеточных
бактериофагов. Мутагенное действие
гидроксиламина на эукариотические
организмы выражено слабо.
Азотистая кислота.
Азотистая кислота HNO2 - сильный
мутаген, действующий путем окислительного
дезаминирования оснований, содержащих
аминогруппы (гуанин, аденин, цитозин).
Замещение аминогруппы кетогруппой
превращает аденин в гипоксантин,
спаривающийся преимущественно
не с тимином, а с цитозином.
Дезаминирование цитозина превращает
его в урацил, спаривающийся с
аденином. Дезаминирование гуанина
переводит его в ксантин, однако
это не нарушает специфичности
спаривания, т.к. оба они образуют
водородные связи с цитозином.
Первые два типа дезаминирования
ведут к транзициям АТ?ГЦ и
ГЦ?АТ соответственно. Поскольку
азотистая кислота индуцирует
транзиции в обоих направлениях,
вызываемые ею мутации способны
ревертировать при повторной
обработке тем же мутагеном.
Помимо замен оснований
азотистая кислота индуцирует
делеции, что обусловлено ее
способностью к поперечному сшиванию
цепей ДНК. У эукариот мутагенное
действие азотистой кислоты, по-видимому,
также связано с вызываемыми
ею сшивками между ДНК и
гистоном. Показана мутагенность
азотистой кислоты в отношении
различных бактерий, бактериофагов,
РНК-вых вирусов, грибов. In vitro азотистая
кислота индуцирует мутации в трансформирующейся
ДНК, но по эффективности уступает в этом
отношении гидроксиламину.
Мутагены, действующие на
реплицирующуюся ДНК
Аналоги оснований - это соединения,
имеющие сходную с нормальными
азотистыми основаниями кольцевую
структуру, отличающиеся от них по химическим
свойствам. Некоторые из аналогов оснований,
например аналог тимина 5-бромурацил (5-БУ)
и аналог пурина 2-аминопурин (2-АП), -
сильные мутагены. Механизм мутагенного
действия аналогов оснований связан
с их более выраженной по сравнению
с нормальными основаниями способностью
к таутомерным переходам: из нормальной
кетоформы в редкую энольную форму
(у пиримидинов) и из нормальной аминоформы
в редкую иминоформу (у пуринов).
Находясь в кетоформе, 5-БУ спаривается
с аденином, а в энольной форме
- с гуанином. Точно так же 2-АП
в аминоформе, подобно аденину, спаривается
с тимином, а в иминоформе - с
цитозином.
Различают два механизма
мутагенного действия аналогов
оснований: ошибки включения и
ошибки репликации. В случае ошибок
включения 5-БУ в редкой энольной
форме спаривается с гуанином
в матричной цепи, а затем уже
в ходе следующего цикла репликации,
перейдя в обычную кетоформу,
спаривается с аденином. В третьем
цикле репликации аденин нормально
спаривается с тимином и таким
образом происходит транзиция
ГЦ?АТ. Сходные рассуждения в отношении
2-АП показывают, что при его
ошибочном включении появится
транзиция того же типа.
В случае ошибок
репликации 5-БУ, первоначально находящийся
в кетоформе, как и тимин,
нормально спаривается с аденином.
При переходе в энольную форму
5-БУ уже в следующем периоде
репликации соединится с гуанином.
Последний в третьем цикле
репликации спарится с цитозином,
что обеспечит возникновение
транзиции АТ?ГЦ. Легко видеть, что
такая же транзиция произойдет,
если в результате ошибки репликации
2-АП заменит аденин и спарится
с тимином. Таким образом, оба
механизма возникновения мутаций
под действием 5-БУ или 2-АП
связаны с заменой пар оснований,
происходящей через три цикла
репликации. Различия между ними
состоят в том, что ошибка
включения проявляется сразу,
а ошибки репликации возникают
в любом из ее циклов, когда
уже включившийся аналог перейдет
в более редкую таутомерную
форму. Фиксация этого предмутационного
события происходит еще через
два цикла репликации и ведет
к возникновению стабильной мутации.
Для того чтобы произошла ошибка
включения, аналог основания должен
присутствовать в среде, а ошибка
репликации может произойти позднее,
когда аналог будет удален
из среды, например, с помощью
отмывки от нее мутагенизируемых
клеток.
Помимо описанного
прямого действия аналоги оснований
могут увеличивать чувствительность
молекул к другим мутагенам
(например, 5-БУ делает ДНК более
чувствительной к УФ-лучам и
ионизирующим излучениям).
Замечено, что замены
нормальных оснований, индуцированные
действием их аналогов, зависят
от локализации первых в нуклеотидной
цепи. Так, в rII области фага
Т4 обнаружены “горячие точки”,
в которых 2-АП и 5-БУ особенно
часто вызывают замены оснований.
Как уже отмечалось, частота, с
которой аналог оснований вызывает
ту или иную транзицию в
данном сайте, зависит от соседних
с ним оснований. На основе
этого сделан вывод о том,
что мутагенное действие аналога
определяется не самим основанием,
а его положением в нуклеотидной
цепи.
Акридины. Акридиновые
красители - акридин оранжевый,
акрифлавин, профлавин, а также
алкилированные акридины (ICR-170, ICR-191)
обладают мощным мутагенным действием,
индуцируя сдвиги рамки считывания
(фреймшифт-мутации). Положительно заряженные
молекулы акридинов, имеющих сходные
с основаниями кольцевые структуры,
но лишенные сахарофосфата, вставляются
между “стопками” пар оснований
в ДНК. Это приводит к нарушению
конформации дуплета ДНК. Генетические
исследования показали, что самой
такой вставки акридинов недостаточно
для возникновения мутаций: в
этом процессе участвует рекомбинация
или репарация ДНК. Предложена
модель, объясняющая возникновение
мутаций сдвига рамки под действием
акридинов вставками или выпадениями
оснований в результате формирования
одноцепочечных петель ДНК в
участках, содержащих повторяющиеся
пары оснований. Возникновение
петли вследствие внедрения акридинов
в места с такими повторами
приводит к удлинению или укорочению
образующейся в ходе репликации
цепи ДНК на одну пару оснований.
Мутанты, не способные ревертировать
под действием соединений, индуцирующих
замены оснований, но ревертирующие
под действием акридина, классифицируют
как мутанты со сдвигом рамки
считывания. Использование акридинов
способствовало установлению триплетной
природы генетического кода.
К мутагенам также,
помимо уже рассмотренных 5-БУ
и 2-АП, относятся азотистая кислота,
гидроксиламин, этилметансульфонат,
N-метил-N?-нитро-N-нитрозогуанидин, метилметансульфонат,
акридины, УФ-лучи, а также рентгеновские
лучи.
Кроме того, в качестве
мутагенов используют и другие
химические соединения, отличающиеся
друг от друга по механизму
действия. Например, известны мутагены,
имитирующие действие УФ-лучей.
К ним относится 4-нитрохинолин-1-оксид,
эффективно реагирующий с ДНК
лишь после активации клеточными
ферментами. Мутагенное действие
формальдегида, взаимодействующего
как с нуклеотидами в ДНК,
так и с нуклеопротеином, обусловлено
образованием сшивок между ДНК
и белком. Соединения, относящиеся
к группе фотосенсибилизирующих
мутагенов, образуют ковалентные
связи с ДНК только при возбуждении
их светом с длиной волны
340-360 нм. Пример таких соединений
- псорален, индуцирующий межнитевые
сшивки ДНК и тем тормозящий
ее репликацию.
К мутагенным факторам
относятся и многие вирусы
человека, животных и растений, а
также некоторые бактериофаги. Показано,
например, что вирус SV40 вызывает
в культуре клеток человека
и обезьян генные мутации и
хромосомные перестройки. Предполагается,
что мутагенность вирусов обусловлена
их ДНК. Работами С.М. Гершензона
и других авторов установлено,
что введение в организм дрозофилы
препаратов ДНК, выделенных из
тканей млекопитающих, птиц, рыб,
насекомых, а также из вирусов,
вызывает большое число генных
мутаций и микроделеций, тогда
как крупные перестройки полностью
отсутствуют. Еще одна особенность
мутагенного действия ДНК состоит
в том, что частота мутаций
в некоторых генах увеличивается
в 100-1000 раз, другие же гены
либо вовсе не мутируют под
действием экзогенной ДНК, либо
мутируют слабо. Это означает,
что в отличие от всех рассмотренных
мутагенов, мутагенный эффект
ДНК избирателен в отношении
определенных генов, т.е. имеет
черты направленного мутагенеза.
Наконец, третья особенность мутагенного
действия препаратов ДНК - его
выраженная продленность, поскольку
мутации индуцируются не только
в F1 мух, получавших ДНК с
кормом, но и во многих последующих
поколениях. Мутагенность чужеродной
ДНК показана и на других
объектах - кукурузе, микроорганизмах.
Механизм этого эффекта препаратов
ДНК не установлен, но предполагается,
что фрагменты экзогенной ДНК
могут проникнуть в половые
клетки и включиться в их
хромосомы.
Специфичность и направленность
индуцированного мутагенеза
Данные по химическому
мутагенезу показывают, что процесс
формирования мутаций многоступенчат
и включает ряд стадий.