Иммуноферментные тест-системы: общая характеристика, разработка и использование в практике микробиологических исследований

Таблица 1 - Пример расхода компонентов тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов коксиелл Бернета 

         Во все лунки стрипов вносят по 100 мкл раствора анти-Ку. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют в течение (12 - 24) ч при температуре (15 - 25) °С. Затем раствор вытряхивают или удаляют с помощью отсасывателя и промывают 2 раза раствором ФСРТ, внося в каждую лунку по (200 - 300) мкл раствора с последующим удалением. Для проверки связывания Ку-антигена одну из лунок (А1) оставляют незаполненной (контроль субстрата). В две лунки вносят по 100 мкл красного раствора К⁺, в две другие лунки вносят по 100 мкл зеленого раствора К^-, в остальные лунки вносят по 100 мкл исследуемых образцов (см п. 4 "Подготовка реагентов"). Планшет закрывают крышкой или помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют в течение 1 ч при температуре (37 ± 1) °С. После инкубации лунки промывают трехкратно раствором ФСРТ. 
          Связывание конъюгата происходит следующим образом: во все лунки, кроме А1, вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 1 ч. 
После инкубации лунки промывают пятикратно раствором ФСРТ. 
          Проведение ферментативной реакции. Во все лунки вносят по 100 мкл субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой и выдерживают в темноте при температуре (15 - 25) °С в течение (20 ± 1) мин. 
          Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 50 мкл раствора серной кислоты. При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и К^- должно оставаться бесцветным или бледно-желтым, а содержимое лунок с К⁺ должно приобрести желтую окраску. 
          Исследуемый образец оценивается как положительный, если имеются отчетливые различия в интенсивности его окрашивания по сравнению с растворами в лунках с контролем субстрата и К^-. 
          Измерение оптической плотности (ОП) проводится при длине волны 450 нм непосредственно в лунках планшета с помощью вертикального фотометра. В качестве кюветы сравнения служит лунка А1 с контролем субстрата. При правильном проведении анализа среднее значение в лунках с К⁺ должно быть не менее 0,80 ± 0,10 единиц ОП, а в лунках с К^- - не должно превышать 0,15 ± 0,05 единиц ОП. 
          Оценка результатов производится следующим образом: если отношение среднего значения ОП (ОП_сред) исследуемого образца к ОП_сред К^- ≥ 3 и при этом ОП_сред исследуемого образца имеет значение выше 0,50 единиц, то этот результат следует оценивать как положительный, если отношение ОП_сред исследуемого образца к ОП_сред К^- < 3 или ОП_сред исследуемого образца < 0,5, то этот результат следует оценивать как отрицательный. Положительный результат ИФА свидетельствует о наличии антигена коксиелл Бернета в исследуемом материале, отрицательный - о том, что данным методом антиген не обнаружен.

Таблица 2 – Пример оценки результатов иммуноферментного анализа. 
 
Проба 1: ОП_сред=0,96 - результат следует оценивать как положительный. 
Проба 2: ОП_сред=0,22 - результат следует оценивать как отрицательный. 
Проба 3: ОП_сред=0,54, то есть ОП_сред исследованной сыворотки равно 3 ОП_сред К^-, и при этом ОП_сред исследуемой сыворотки имеет значение выше 0,50 единиц, этот результат следует оценивать как положительный. 
         Тест-систему иммуноферментную для выявления антигенов коксиелл Бернета выпускают в виде комплекта, упакованного в коробку. Один комплект рассчитан на проведение от 1 до 96 анализов, включая контроли. 
          Комплект тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов коксиелл Бернета хранить при температуре (4 - 6) °С. Транспортировку осуществлять всеми видами крытого транспорта при температуре не выше 25 °С не более 2 недель.  Срок годности тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов коксиелл Бернета - 6 месяцев со дня выпуска[29].

4.3 Иммуноферментная тест-система для обнаружения антител класса G (на примере возбудителя лихорадки Ку)

          Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii обеспечивает выявление в сыворотке крови человека антител класса IgG к антигенам Coxiella burnetii - возбудителю Ку-лихорадки. 
          Выявление антител осуществляется посредством их взаимодействия с сорбированными на полистироловых планшетах антигенами Coxiella burnetii. Визуализацию комплексов антиген-антитело производят с помощью конъюгата, представляющего собой поликлональные IgG(H+L)-антитела, меченные пероксидазой хрена. Тест-система иммуноферментная предназначена для серологической текущей и ретроспективной диагностики Ку-лихорадки. В состав набора тест-системы иммуноферментной для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii входят:

1) Комплект из 12 стрипов в рамке, сорбированных антигеном C. burnetii - 1 шт.

2) Положительная контрольная сыворотка (К⁺), содержащая антитела к C. burnetii, инактивированная прогреванием, по 1,5 мл, (малиновый раствор). Готова к применению без предварительного разведения - 1 пр.

3) Отрицательная контрольная сыворотка (К^-), не содержащая антител к C. burnetii, инактивированная прогреванием, по 1,5 мл (жёлто-зелёный раствор). Готова к применению без предварительного разведения - 1 пр.

4) Концентрат конъюгата, меченного пероксидазой хрена (Концентрат конъюгата), по 0,25 мл (синий раствор) - 1 пр.

5) Концентрат фосфатно-солевого раствора, содержащий детергент (ФСРТ), по 20 мл (бесцветный раствор) - 1 фл.

6) Натрия хлорид, сухой (10 г) - 1 уп.

7) Цитратный буферный раствор с перекисью водорода (ЦБП), по 10,0 мл (бесцветный раствор) - 1 фл.

8) Раствор тетраметилбензидина (ТМБ), 2,5 мл (бесцветный раствор) - 1 фл.

9) Раствор для разведения конъюгата (РРК), 10,0 мл - 1 фл.

10) Раствор для разведения исследуемых проб (РИП) (синий раствор), 10,0 мл - 1 фл.

11) Раствор серной кислоты (Стоп-реагент), 5,0 мл (бесцветный раствор) - 1 фл.

12) Полиэтиленовый пакет с молнией - 1 шт.

13) Инструкция по применению - 1 шт.

          Все растворы и реагенты необходимо выдержать перед началом работы при температуре (15 - 25) °С в течение 30 мин. Иммуноферментный анализ (ИФА) рекомендуется проводить с использованием новых, не подвергавшихся обработке наконечников для пипеток, работать в резиновых перчатках. Все использованные материалы подвергать обработке дезинфицирующими растворами (6 % раствором перекиси водорода или монохлорамина). 
          Для получения рабочего раствора содержимое флакона с концентратом ФСРТ перенести в мерную колбу ёмкостью 500 мл и довести объём до метки дистиллированной водой. Перелить содержимое колбы в стакан, добавить содержимое пакета с хлоридом натрия и перемешивать до полного растворения последнего. Раствор хранить до 6 мес при температуре (4 - 6) °С. 
          Для получения необходимого (1:400) разведения сыворотки следует произвести предварительное разведение, смешав 5 мкл исследуемой сыворотки с 95 мкл РИП (разведение - 1:20), используя дополнительный ряд микропробирок. В случае необходимости титрования сывороток разводить их раствором РИП с шагом 2. Разведённую сыворотку не хранят.  
           Концентрат конъюгата развести на растворе РРК 1:80. При этом раствор меняет свою окраску от синего до сиреневого цвета. Необходимый объём раствора конъюгата определяется числом используемых стрипов. Хранить не более 4 час при температуре (4 - 6) °С. 
           В зависимости от количества используемых стрипов готовят необходимый объем субстратного раствора путем смешивания соответствующих объемов реагента ТМБ и ЦБП перед проведением ферментативной реакции. Полученный субстратный раствор должен оставаться бесцветным или слегка голубоватым. Необходимый объём раствора субстрата определяется числом используемых стрипов (см. таблицу 3).

Таблица 3 - Таблица расхода  компонентов тест-системы иммуноферментной для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii (указан с  избытком) 

           Для исключения ложноположительных результатов исследуемые сыворотки необходимо готовить и хранить в стерильных условиях, исключающих возможность бактериального пророста. Необходимо осветлять образцы сывороток, содержащих осадок и агрегаты, путём центрифугирования. Не использовать сыворотки с выраженным гемолизом, гиперлипидемией и бактериемией. Для выявления антител к антигенам коксиелл Бернета возможно использование сыворотки крови людей как свежей, так и хранившейся при 2 - 10 °С не более 48 часов после забора крови, либо замороженной и хранившейся (исключить промежуточное оттаивание) при минус 20 °С не более 6 месяцев. Для приготовления реагентов и проведения ИФА используют чистую мерную посуду и автоматические пипетки с погрешностью измерения объёмов не более 5 %. Для каждого реагента и пробы используют чистые наконечники для пипеток. 
          Гидратация сорбированного Ку-антигеном планшета. Во все лунки стрипов внести по 200 - 300 мкл раствора ФСРТ. Инкубировать в течение 1 - 2 мин при температуре 15 - 25 °С. Удалить содержимое лунок в ёмкость с дезинфицирующим раствором, удалить остатки содержимого лунок лёгкими постукиваниями перевёрнутой рамки по стопке фильтровальной бумаги. 
          Одну из лунок (А1) оставляют незаполненной в качестве контроля субстрата, в лунки В1 и С1 внести по 100 мкл красного раствора К⁺, в D1 - 100 мкл зеленого раствора К^-. В лунки E1, F1, G1 и H1 внести по 95 мкл раствора ФСРТ и по 5 мкл предварительно в 20 раз разведённых в РИПе исследуемых сывороток в дубле. Таким образом, исследуемая сыворотка в лунке разбавляется в 400 раз. Для получения корректных результатов исследуют сыворотки в дубле и для каждой делать два независимых разведения. Планшет закрыть крышкой или поместить во влажный полиэтиленовый пакет и инкубировать в течение 1 часа при температуре (37 ± 1) °С. После инкубации лунки промыть трехкратно раствором ФСРТ. 
          Связывание конъюгата. Во все лунки кроме А1 внести по 100 мкл рабочего раствора конъюгата сиреневого цвета. Планшет закрыть крышкой или поместить во влажный полиэтиленовый пакет и инкубировать при температуре (37 ± 1) °С в течение 1 часа во влажной камере. После инкубации лунки промыть пятикратно раствором ФСРТ. 
           Проведение ферментативной реакции. Во все лунки внести по 100 мкл субстратного раствора, приготовленного непосредственно перед проведением реакции. Планшет закрыть крышкой и выдержать в темноте при температуре (15 - 25) °С в течение (20 ± 1) мин. Реакцию необходимо остановить внесением в каждую лунку по 50 мкл раствора серной кислоты и перемешать. Измерить оптическую плотность при длине волны 450 нм, используя фотометр. Выведение фотометра на нулевой уровень ("бланк") осуществлять по лунке А1. Окраска в лунках стабильна в течение 20 мин. 
          При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и К^- должно оставаться бесцветным или бледно-желтым, а содержимое лунок с К⁺ должно приобрести желто-коричневую окраску. 
           Результаты эксперимента регистрируются, если: 
- значение ОП контрольной отрицательной сыворотки - ОП_срК^- ≤ 0,2; 
- среднее значение контрольной положительной сыворотки ОП_срК⁺ ≥ 0,80. 
          Интерпретацию результатов для каждой анализируемой сыворотки следует проводить, используя таблицу. 
Таблица 4 -  Интерпретация результатов ИФА выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii 

           Положительный результат ИФА, то есть выявление антител к C. burnetii, может свидетельствовать как о текущем заболевании Ку-лихорадкой, так и об инфицированности (или иммунизации) C. burnetii в прошлом. 
          Для постановки окончательного диагноза Ку-лихорадки необходим комплекс серологических, клинических и эпидемиологических данных. 
           Тест-систему иммуноферментную для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii выпускают в виде комплекта, упакованного в коробку. Один комплект рассчитан на проведение от 1 до 96 анализов, включая контроли. 
          Хранение и транспортирование проводят в соответствии с СП 3.3.2.028-95 при температуре (2 - 8) °С. Транспортировку осуществлять всеми видами крытого транспорта при температуре (2 - 8) °С не более 2 недель. 
            Срок годности тест-системы иммуноферментной для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii - 6 месяцев со дня выпуска[29].

4.4 Иммуноферментные тест-системы для серодиагностики сифилиса

           В лабораторной диагностике сифилиса ведущее место занимает серодиагностика. В настоящее время в нашей стране тест-системы ИФА разрабатываются по трем схемам проведения реакции. 
          Первая схема: на твердофазном носителе (чаще лунки полистиролового планшета) фиксируется антиген возбудителя сифилиса, после чего он инкубируется с испытуемой сывороткой или плазмой крови. При наличии в этом материале от пациентов противотрепонемных антител происходит их связывание в комплекс антиген - антитело (1-я фаза реакции). После удаления несвязавшихся иммуноглобулинов следует инкубация с меченными ферментом антителами к иммуноглобулинам человека (конъюгат), в ходе которой на поверхности носителя происходит присоединение к имеющимся комплексам антиген - антитело антител, меченных ферментом (2-я фаза). После удаления несвязавшегося конъюгата в ходе инкубации с раствором субстрата (в случае использования пероксидазного конъюгата это ортофенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота или тетраметилбензидин в сочетании с перекисью водорода) происходит взаимодействие фермента с субстратом, в результате чего развивается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител (3-я фаза). Результат реакции оценивается спектрофотометрически с выводом цифровых данных, что исключает субъективность оценки, или визуально, что может быть полезно при отсутствии в лабораториях соответствующего оборудования. По такому принципу в настоящее время построено большинство тест-систем ИФА для диагностики сифилиса. 
          Вторая схема - ИФА с фиксированными антителами, или "ловушка для антител". Здесь на твердофазном носителе фиксируются афинно очищенные антитела к определенному классу иммуноглобулинов (M, C или A), которые находятся в испытуемых сыворотках крови. Образование комплекса антитело - специфический иммуноглобулин выявляют с помощью конъюгата, состоящего из антигенов бледной трепонемы, меченных ферментом. При инкубации с субстратом при наличии сифилитических антител в испытуемой сыворотке или плазме крови наступает окрашивание раствора. Разрабатываются подобные наборы для выявления противотрепонемных IgM. 
           Третья схема ИФА используется в тест-системах для выявления суммарных антител, специфических для определения антигена, независимо от их класса. Ее суть заключается в том, что специфические сывороточные антитела одновременно взаимодействуют с антигеном, зафиксированным на твердофазном носителе, и с тем же антигеном, меченным ферментом, при совместной инкубации сыворотки крови и конъюгата. Наличие фермента в образовавшемся комплексе определяют с помощью субстрата[30]. 
           Результаты ИФА при использовании всех тест-систем с автоматическим учетом регистрируют на спектрофотометре для планшет немедленно после остановки реакции с измерением оптической плотности (ОП) раствора субстрата при длине волны 492 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень осуществляют по воздуху. Учет результатов реакции проводят согласно методике и цифровым данным, изложенным в инструкции по применению, имеющейся в каждом используемом наборе. При автоматическом учете результатов реакции по величине цифровых показателей ОП в лунках с испытуемыми образцами судят о концентрации специфических антител в исследуемой сыворотке крови. В связи с этим данный метод оценки результатов называют количественным. Образец сыворотки крови учитывают как положительный, если значение ОП данного образца выше критического уровня (ОП_крит), вычисляемого по формуле при осуществлении каждой постановки реакции или иным способом в соответствии с инструкциями по применению. 
          При учете результатов реакции все тест-системы ИФА невозможно привести к единому стандарту. Один и тот же образец может давать в разных тест-системах совершенно иной уровень окрашивания раствора субстрата. Это зависит от конструкции самой тест-системы, используемого антигена, концентрации конъюгата и др., а также от величины ОП_крит. Поэтому более точной оценкой результатов ИФА является титр противотрепонемных антител для каждого положительного образца. С целью определения титра производят последовательные двукратные разведения испытуемой сыворотки крови. За титр принимают наибольшее разведение сыворотки крови, дающее положительный результат. Титр является количественным показателем уровня специфических антител в данном образце и степени его позитивности. Это имеет особое значение при оценке эффективности противосифилитического лечения, но следует учитывать, что повторное исследование сыворотки крови следует проводить с той же тест-системой. 
          Как при визуальном, так и при спектрофотометрическом учете результатов ИФА бывают сомнительные случаи, которые при автоматическом учете располагаются в "серой зоне" (интервал от ОП_крит - 10% до ОП_крит + 10%). Те значения ОП, которые лежат выше этой зоны, соответствуют положительному результату. Образцы с сомнительным результатом подлежат повторному исследованию. 
           В настоящее время ряд предприятий осуществляет производственный выпуск оригинальных тест-систем ИФА на сифилис в виде многокомпонентных наборов, содержащих все реагенты, необходимые для проведения реакции, и инструкцию по их применению. Сравнительная характеристика отечественных тест-систем ИФА на сифилис представлена в таблице 5[31].

Таблица 5 – Сравнительная  характеристика российских тест-систем ИФА на сифилис

Диагностика сифилиса с  помощью ИФА представляет собой  эффективный метод. Недопустимы  продажа и использование в  медицинской практике тест-систем, не имеющих утвержденной фармакопейной статьи и разрешения Минздрава РФ на их применение в практике здравоохранения[32].

          5 Заключение

          Оценивая диагностические возможности  иммуноферментных тестов, следует  отметить, что, как и у других  иммунологических реакций, они зависят от целого ряда причин. Основные из них связаны с методическими особенностями проведения анализа, характером и качеством используемых реагентов, спецификой определяемых веществ, а также со способом регистрации результатов и наличием мешающих примесей.