Иммуноферментные тест-системы: общая характеристика, разработка и использование в практике микробиологических исследований

Все  разрабатываемые ИФА-наборы, предназначенные для выявления специфических антител к соответствующему антигену или непосредственно для выявления самого антигена, проходят широкомасштабные испытания в различных хозяйствах и регионах нашей страны и подлежат регистрации и сертификации в установленном порядке[25].

        

 

3.2 Подбор оптимальных условий постановки ИФА

          Чувствительность диагностических  систем лишь частично зависит  от типа выбранной при конструировании  диагностикума фермент-субстратной  пары. В основном эта чувствительность определяется другими факторами, которые трудно учесть: способом синтеза конъюгата, гомогенностью и удельной активностью используемых для такого синтеза антител и антигенов, а также многочисленными параметрами проведения анализа (способом иммобилизации выявляемого антигена или антител, степенью их солюбилизации в биологическом или клиническом образце и т. д.). На основании анализа этих данных трудно рекомендовать при конструировании вновь создаваемых твердофазных иммуноферментных систем наилучший фермент и наулучший субстрат. Следует лишь отметить, что с помощью использованных ранее фермент-субстратных пар метод ИФА позволяет выявить в исследуемом образце нанограммовые количества антигена при использовании хромофорных субстратов и пикограммовые количества антигена при применении флюорохромных субстратов.

           Если при конструировании новой  системы невозможно или нежелательно  использование коммерческих универсальных  конъюгатов (антивидовых фермент-меченных  антител), то встает вопрос о  синтезе конъюгата на основе выбранных фермента и антител. Наиболее специфичные и высокоактивные конъюгаты могут быть получены на основе только максимально очищенных белковых ингредиентов. Однако в связи с относительной сложностью и трудоемкостью работ по тщательной очистке бактериальных и вирусных антигенов в настоящее время при разработке иммуноферментных систем часто используются либо цельные сыворотки, либо суммарные фракции иммуноглобулинов, содержащие в своем составе как специфические, так и балластные антитела. Антигены также часто не подвергаются надлежащей очистке, и используемый при конструировании диагностикума белок составляет лишь небольшой процент от суммарного белка. В связи с этим резко повышается вероятность неспецифических реакций.

          3.2.1 Проверка различных сероваров микроорганизмов  в качестве специфического  антигена

В ИФА в качестве антигенов  испытываются суспензии инактивированных нагреванием целых клеток различных  сероваров микроорганизмов.

Изучение серологической специфичности  антигенов проводят, раститровывая на них гомологичные и гетерологичные гипериммунные сыворотки. В качестве контролей служат анти-сыворотки, полученные от животных.

          3.2.2 Подбор оптимальной концентрации антигенов для сенсибилизации планшет

          Степень связывания белков с полистироловым носителем непосредственно зависит от многих причин, среди которых и содержание белка в сенсибилизирующем растворе. При использовании растворов с высоким содержанием белка на единицу поверхности эффективность адсорбции снижается и в результате большее количество белка подвергается последующей десорбции. Наблюдаемое при этом ослабление прочности связывания в литературе объясняется насыщением поверхности носителя.

Изучается влияние сенсибилизирующей  концентрации инактивированных корпускулярных антигенов из различных штаммов и их сероваров на величину показателей ОП положительных сывороток при постановке твердофазного ИФА. Для постановки ИФА используют  разведения антигенов различными значениями оптической плотности суспензии (ОП₅₄₀): 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 и 0,01 о.е. мутности. Антигены вносят в лунки полистироловой планшеты, осуществляли ее сенсибилизацию, инкубируя в течение определенного времени при нужной температуре. После отмывки в лунки планшеты вносят положительную анти-сыворотку  Проводят инкубацию планшеты. После отмывки лунок от несвязавшихся антител в них добавляли анти-видовой пероксидазный конъюгат в подобранном рабочем разведении. После инкубации с конъюгатом и отмывки учитывают результаты реакции с субстратом по оптической плотности образовавшегося реакционного продукта.

          3.2.3 Определение оптимального времени сенсибилизации иммунологических планшет антигенами

          Степень связывания белков с  полистироловым носителем непосредственно  зависит от продолжительности их контакта. Увеличение времени инкубации не всегда приводит к повышению чувствительности определения. Поэтому в каждом случае необходимо проверять, происходит ли при более длительной инкубации улучшение результатов анализа.

Влияние продолжительности  инкубации на адсорбцию антигенов на плашках изучают с использованием оптимальной концентрации микробных клеток, определяемой в предыдущем опыте. Сенсибилизацию лунок антигенами проводят в течение нескольких временных интервалов (5, 10, 15, 30, 60 и 120 минут), после чего плашки промывают.

После сенсибилизации в лунки вносили  положительные анти-сыворотки и отрицательные сывороток здоровых животных, взятых в одном разведении повторностях. Далее опыт проводят по обычной схеме.

          3.2.4 Подбор оптимального значения рН буферной системы для сорбции антигенов и антител

Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФА, является рН комплексирующего буфера, используемого  для разведения антигенов и антител.

Планшеты сенсибилизируют  антигенами. Сенсибилизацию проводили в  ранее подобранных оптимальных условиях (оптимальная концентрация антигена, оптимальное время). После чего на каждый антиген вносят анти-сыворотку и отрицательные сыворотки животных в повторностях.

        

 

3.2.5 Подбор оптимального режима инкубации сывороток и конъюгатов

Для определения температурного режима инкубации сывороток и  конъюгатов на результаты ИФА используют планшеты, сенсибилизированные антигенами с учетом подобранных выше условий.

Положительные (анти-сыворотки) и негативные сыворотки инкубировали с антигенами при 37^оС или при комнатной температуре (22-24^оС) в течение 1 часа.

          3.2.6 Влияние сроков хранения планшет, сенсибилизированных антигенами, на результаты ИФА

          Одним из факторов, влияющих на  эффективность ИФА и срок годности тест-системы, является нарушение связи антигена с носителем в условиях хранения. Для определения влияния продолжительности хранения  плашек, сенсибилизированных антигенами, на результаты анализа, в опыте проверяютсяпланшеты, хранившиеся после нанесения на них антигенов при различных температурах в течение разного срока.

          3.2.7 Проверка специфичности и чувствительности тест-систем 
          Под чувствительностью понимается та минимальная концентрация определяемого реагента, при которой заметно различие в величине сигнала этой концентрации и образца, заведомо не содержащего определяемого реагента (отрицательный контроль). Эта разница в величине сигналов должна составлять 2 - 3 величины стандартного отклонения (СО) для отрицательного контроля. 
          Для качественной диагностики, когда важно наличие или отсутствие антител в исследуемой пробе используют положительно-отрицательный метод. Положительным значением (+) считают величину сигнала, которая в 2 - 3 раза превышает сигнал от контрольного образца, не содержащего определяемые антитела (-). Процент положительных проб представляет собой выявляемость метода.

Также на чувствительность влияет ферментативная активность коньюгата. Наряду с ферментативной активностью конъюгата большое влияние на чувствительность анализа оказывает тип используемого субстрата. Продукт ферментативного превращения субстрата должен обладать новым физико-химическим параметром, позволяющим детектировать его с высокой чувствительностью. Такими параметрами являются: поглощение света в видимой области (хромофорные субстраты), флуоресценция в видимой области (флуоресцентные субстраты) и хемилюминисценция (хемилюминисцентные субстраты). 
           Высокая чувствительность ИФА достигается также благодаря использованию различных физических методов регистрации ферментативной активности: фотометрических, флуориметрических, био- и хемилюминесцентных. Как всякий аналитический метод, ИФА имеет свои ограничения, связанные с биологической природой молекул детектора (антитела) и усилителя (фермента). Применение ИФА в диагностических целях требует изучения причин неспецифических реакций и их устранения.  Как высокочувствительный метод ИФА чрезвычайно зависит от качества реагентов и техники проведения исследования[26].

           4 Иммуноферментных тест-системы в микробиологических исследованиях

           Многие иммунологические системы  детекции обладают высокой чувствительностью  и специфичностью, являясь в то  же время достаточно простыми. Они широко используются для тестирования лекарственных препаратов, оценки и мониторинга различных онкологических заболеваний, определения специфических метаболитов, идентификации и контроля патогенных микроорганизмов. Применение данных систем возможно при условии, что анализируемый компонент должен обладать свойствами антигена, то есть способностью вызывать в организме человека или животных синтез особых белков – антител, с высокой специфичностью связывающих антиген. В качестве антигена могут быть клетки микроорганизмов, вирусы, белки и полисахариды.  
          Иммуноферментный анализ для определения антигенов и антител к микроорганизмам находит все более широкое применение в практике. В настоящее время по частоте применения он не уступает, а во многих случаях превосходит другие методы иммунохимического анализа. При бактериальных, вирусных, паразитарных заболеваниях с его помощью определяют различные антигены микробов и антитела к ним, относящиеся к разным классам иммуноглобулинов.

При использовании иммуноферментных тест-систем возможно проведение эпидемиологических обследований, выявление отравлений, определение наличия наркотиков в крови, определение содержания лекарственных соединений в тканях, определение антибиотиков, витаминов и других биологически активных соединений; возможно использование при отборе активных штаммов-продуцентов в промышленной биотехнологии, контроль за качеством медицинских препаратов из донорской крови на отсутствие вирусов-возбудителей СПИДа и гепатита В[27].

4.1 Возможности использования коммерческих препаратов для лабораторной диагностики заболеваний

Быстрые темпы распространения  инфекционных болезней в популяции  человека, а также высокая изменчивость возбудителей, вынуждают ученых всего  мира постоянно совершенствовать тесты  для in vitro диагностики и разрабатывать все новые их модификации. Среди коммерческих методов серологической диагностики ИФА получил самое бурное развитие. В настоящее время разработаны и производятся иммуноферментные тест-наборы для диагностики гепатитов А, В и С, ВИЧ-инфекций, TОRCH-инфекций (токсоплазмоз, краснуха, цитомегаловирус, вирус простого герпеса), сифилиса, урогенитального хламидиоза, микоплазмоза и уреаплазмоза, хеликобактериоза, туберкулеза, лептоспироза, Ку-риккетсиоза, вируса паратита, кандидоза, стафилококковай и стрептококковай инфекций, мононуклеоза, аутоиммунных заболеваний и др.[28].

   4.2 Иммуноферментная  тест-система для обнаружения  антигенов (на примере возбудителя лихорадки Ку)

          Тест-система иммуноферментная для выявления антигенов Coxiella burnetii обладает способностью выявлять антигены Coxiella burnetii (Ку-антиген) за счет их связывания с поликлональными антителами, сорбируемыми на поверхности лунок стрипов. Образующийся комплекс антитело-антиген выявляется с помощью пероксидазного коньюгата на основе поликлональных антител по появлению желтого окрашивания на этапе ферментативного превращения субстратного раствора. 
          Несмотря на то, что входящие в тест-систему иммуноферментную для выявления антигенов коксиелл Бернета контрольные образцы (К⁺ и К^-) инактивированы, с системой следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом: работать в резиновых перчатках; все использованные материалы подвергать обработке дезинфицирующими растворами (6 % раствором перекиси водорода или монохлорамина); использованные наконечники обрабатывать 20 % раствором этилового спирта. 
          Тест-система предназначена для выявления Ку-антигена в объектах внешней среды (в смывах со шкур коров, коз и овец) и материалах биологического происхождения (в органах животных, клещах и т. д.). Кроме того данная тест-система может использоваться для стандартизации антигенов и вакцин, приготовленных из коксиелл Бернета. 
          В состав набора тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов коксиелл Бернета:

1) Восьмилуночные стрипы - 12 шт.

2) Концентрат анти-Ку антител для сорбции, (Концентрат анти-Ку), 0,6 мл, (бесцветный раствор) - 1 пр.

3) Позитивный контрольный образец, содержащий антиген коксиелл Бернета, (К⁺), 1,2 мл, (красный раствор) - 1 пр.

4) Негативный контрольный образец, содержащий гетерологический антиген, (К^-), 1,2 мл, (зеленый раствор) - 1 пр.

5) Конъюгат - поликлональные антитела к коксиеллам Бернета, меченные пероксидазой хрена, (Концентрат конъюгата), 0,2 мл, (синий раствор) - 1 пр.

6) Физиологический раствор (ФР), 10,0 мл, (голубой раствор) - 1 фл.

7) Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора, содержащий детергент-твин-80 (ФСРТ), 20,0 мл, (бесцветный раствор) - 1 фл.

8) Цитратный буферный раствор с перекисью водорода (ЦБП), 10,0 мл - 1 фл.

9)Раствор для разведения конъюгата (РРК), 10,0 мл - 1 фл.

10) Раствор тетраметилбензидина (ТМБ), (бесцветный или слегка голубоватый раствор), 2,5 мл - 1 фл.

11) Раствор серной кислоты, (Стоп реагент), 5,0 мл, (бесцветный раствор) - 1 фл.

12) Полиэтиленовый пакет с молнией - 1 шт.

13) Инструкция по применению - 1 шт.

          Все растворы и реагенты необходимо выдержать перед началом работы при температуре (15 - 25) °С в течение 30 мин. Иммуноферментный анализ (ИФА) рекомендуется проводить с использованием новых, не подвергавшихся обработке наконечников для пипеток. В зависимости от числа исследуемых проб отбирают необходимое количество стрипов (полосок по 8 лунок в каждой). Остальные стрипы вынимают из рамки-держателя и хранят в закрытом полиэтиленовом пакете с молнией при температуре (4 - 6) °С. Растворы каждого компонента тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов коксиелл Бернета и каждого исследуемого образца необходимо брать с помощью индивидуального наконечника для пипеток.  
           Материалом для исследования служат: 
          а) внутренние органы животных, клещей растирают в стерильной фарфоровой ступке и готовят 25 % суспензию в 0,9 % растворе хлорида натрия. Полученную суспензию подвергают трехкратной процедуре замораживания-оттаивания, инактивируют в водяной бане при температуре 100 °С в течение 20 мин и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин. Дальнейшее исследование проводят с супернатантом; 
          б) смывы берут ватным тампоном, смоченном в 0,9 % растворе хлорида натрия, с поверхности не менее 200 - 300 см², тампон помещают в стерильную пробирку, содержащую 2 - 5 мл 0,9 % раствора хлорида натрия. Перед исследованием тампон тщательно отмывают, содержимое пробирки инактивируют на водяной бане при температуре 100 °С в течение 20 мин и исследуют. 
          Для получения рабочего раствора содержимое флакона с концентратом ФСРТ доводят до 500 мл дистиллированной водой. Раствор хранят до 4 мес при температуре (4 - 6) °С. Для получения рабочего раствора анти-Ку для сорбции концентрат анти-Ку разводят 1:20 на растворе ФР. Необходимый объем раствора анти-Ку определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранят до 4 ч при температуре (4 - 6) °С. Концентрат конъюгата разводят на растворе РРК 1:80. Необходимый объем раствора конъюгата определяется числом используемых стрипов (см. пример 1). Хранят до 4 ч при температуре (4 - 6) °С. Субстратный раствор готовят перед проведением ферментативной реакции. Необходимый объем раствора субстрата определяется числом используемых стрипов (см. таблица 1). Хранению не подлежит.