Иммуноферментные тест-системы: общая характеристика, разработка и использование в практике микробиологических исследований

Вятский государственный  университет

Биологический факультет

Кафедра микробиологии

 

 

 

 

 

Курсовая работа по дисциплине

«Медицинская биотехнология»

Иммуноферментные  тест-системы: общая характеристика, разработка и использование в  практике микробиологических исследований.

 

 

 

 

 

Разработал студентка гр. МБ-21 ________________ /Владимирова Е.С./

(подпись)

Руководитель д.б.н., профессор________________ /Шевцов А.Н./

(подпись)

Работа защищена с  оценкой «__________» «___» _______2013 г.

Члены комиссии: ___________/________________/_____________

(подпись)

________________ / ____________/_____________

(подпись)

 

 

 

Киров 2013

Реферат

Владимирова Е.С. Вятский  государственный университет. Отчет: Курс.

работа / ВятГУ, каф. микробиологии; рук. А.Н.Шевцов. - Киров,

2013. Отчет 46 с.,  30 источников.

 

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ, ТЕСТ-СИСТЕМЫ, ПЛАНШЕТЫ, ФЕРМЕНТЫ, СУБСТРАТЫ, АНТИТЕЛА, АНТИГЕНЫ, ВОЗБУДИТЕЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

 
Объект разработки – Вятский  государственный университет.

 

Цель курсовой работы - углубленное изучение характеристик, разработки и использования иммуноферментных тест-систем, анализ применения иммуноферментных тест-систем в микробиологической практике, что способствует повышению теоретического уровня подготовки, а также в развитии навыков формирования своей собственной позиции по изученной проблеме.

Метод проведения работы - изучение научной литературы по избранной теме,  ознакомление с различными подходами и точками зрения.

Рассматриваются вопросы, связанные с методами и компонентами иммуноферментного анализа, разработкой и возможностями использования иммуноферментных тест-систем в микробиологических исследованиях.

 

 

 

 

 

 

 

 

Содержание

Введение…………………………………………………………………………...6

1 Иммуноферментный анализ……………………………………………………7

1.1 Преимущества метода ИФА………………………………………………7

1.2 Краткая характеристика компонентов, используемых в ИФА…...……………………………………………….…………...…….…….8

1.2.1 Ферменты……………………………………………………………..8

1.2.2 Субстраты………………………………………………………….....8

1.2.3 Антигены и антитела………………………………………………...9

1.2.4 Ферментный конъюгат……………………………………………..11

1.2.5 Твердая фаза………………………………………………………...12

2 Иммуноферментные тест-системы…………………………………………...14

2.1 Классификация ИФА тест-систем………………………………………14

2.2 Общая характеристика иммуноферментных наборов…….…………...16

2.3 Параметры, указываемые производителем при изготовлении тест-систем…………………………………………………………………………17

2.4 Общие рекомендации к использованию наборов ИФА………………..17

3 Разработка ИФА тест-систем…………………………………………………19

3.1 Современные подходы к разработке ИФА тест-систем……………….20

3.2 Подбор оптимальных условий постановки ИФА………….…………...21

3.2.1 Проверка различных сероваров микроорганизмов  в качестве специфического  антигена………………………………………………..22

3.2.2 Подбор оптимальной концентрации антигенов для сенсибилизации планшет…………………………………………………22

3.2.3 Определение оптимального времени сенсибилизации иммунологических планшет антигенами……………………………..…23

3.2.4 Подбор оптимального значения рН буферной системы для сорбции антигенов и антител………………………………….…………23

3.2.5 Подбор оптимального режима инкубации сывороток и конъюгатов………………………………………………………………...24

3.2.6 Влияние сроков хранения планшет, сенсибилизированных антигенами, на результаты ИФА……………………………………...…24

3.2.7 Проверка специфичности и чувствительности тест-систем….….24

4 Иммуноферментных тест-системы в микробиологических исследованиях……………………………………………………………………25

4.1 Возможности использования коммерческих препаратов для различных       методов лабораторной диагностики при идентификации микроорганизмов………………………………………………...…………...26 
4.2 Иммуноферментная тест-система для обнаружения антигенов (на примере возбудителя лихорадки Ку)………………………………………..28

4.3 Иммуноферментная тест-система для обнаружения антител класса G (на примере возбудителя лихорадки Ку)……………………………...……32

4.4 Иммуноферментные тест-системы для серодиагностики сифилиса….38

5 Заключение………………………………………………………….……….…35 
Список используемой литературы 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

В настоящем отчете применяю следующие определения, обозначения, сокращения:

Ig - иммуноглобулин

Ig G, Ig А, Ig М, Ig Е, Ig D – классы сывороточных иммуноглобулинов

АГ - антиген

АТ – антитело

БСА – бычий сываточный альбумин

ВИЧ – вирус иммунодефицита человека

ИФА – иммуноферментный анализ

МкА – моноклональные антитела

НТД – нормативно-техническая документация

ОБТК – отдел биологического и технологического контроля

ОП – оптическая плотность

РИА – радиоиммунологический анализ

РНГА – реакция непрямой агглутенации

СО – стандартное отклонение

СПИД  – Синдром приобретённого иммунного дефицита

СЭС – Санитарно-эпидемиологическая служба

ТМБ - 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Современная микробиология  характеризуется развитием диагностических  технологий, основанных на глубоких фундаментальных знаниях биологии микроорганизмов и  повышения эффективности анализа, так как ранняя лабораторная диагностика, занимают основное место в системе противоинфекционных мероприятий[1].

Развитие ИФА связано  с поиском более простого и высокочувствительного способа улавливания минимальных количеств антигенов различного происхождения и антител к ним. Явные преимущества этого метода, к которым относится простота выполнения, доступность и высокая стабильность реагентов, легкость методов визуальной и приборной регистрации, быстрота и возможность автоматизации для проведения массовых анализов, обеспечили его прочное положение в клинической биохимии, при диагностике заболеваний растений, животных и человека, а также в научных исследованиях[2].

В настоящее время опубликовано значительное количество работ, свидетельствующих  о перспективности использования  иммуноферментных реакций в лабораторной диагностике практически всех известных  на сегодняшний день опасных инфекционных заболеваний. Например, имеются многочисленные сообщения, указывающие на высокую эффективность ИФА при обнаружении и идентификации бактерий чумы, сибирской язвы, бруцеллёза, туляремии, холеры, сапа, мелиоидоза. При этом отмечается пригодность данного метода не только для тестирования чистых микробных культур, но и образцов материалов, отбираемых от больных или погибших людей и животных, а также из объектов окружающей среды[3].

Целью данной курсовой работы являлось углубленное изучение характеристик, разработки и использования иммуноферментных тест-систем, а также анализ применения иммуноферментных тест- систем в микробиологической практике.

Задачи выполнения курсовой работы –закрепление и расширение знаний об иммуноферментном анализе и современных иммуноферментных тест-системах.

            1 Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ  — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, диагностики инфекционных заболеваний, в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала[4].

Иммуноферментный анализ получил широкое распространение в связи с высокой чувствительностью и специфичностью, высокой производительностью, простотой проведения анализа и регистрации результатов, возможностью использования микроколичества диагностического материала и автоматизации процесса[5].

1.1 Преимущества метода  ИФА

Основными достоинствами  иммуноферментного анализа являются: высокая чувствительность, позволяющая определять концентрации порядка 0,05 нг/мл; возможность исследования минимального объема биологического субстрата; возможность длительного хранения ингредиентов, необходимых для проведения исследований (обычно более года); возможность автоматизировать проведение исследований; возможность как визуального, так и инструментального учета результатов; низкая стоимость диагностических наборов и тест-систем; объективность за счёт автоматизации учёта результатов; экологическая безопасность для медицинского персонала; простота проведения исследований – всё это обеспечило их прочное положение в разных областях диагностических исследований, включая обнаружение и идентификацию биологических агентов бактериальной и токсинной природы[6].

          1.2 Характеристика компонентов, используемых в ИФА 
          1.2.1Ферменты 
           В качестве меток антигенов и антител в ИФА используют разные виды энзимов.  
           Ферментные метки обладают чрезвычайно мощным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами: высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками; наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции; возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению; отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости; быть доступными при достаточно высоких степенях очистки. С учётом указанных критериев, в настоящее время в практике иммунохимических исследований для маркировки антигенов и антител чаще всего применяют пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и b-D-галактозидазу. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. При этом в большинстве случаев предпочтение отдаётся первому из вышеназванных веществ. Его основные преимущества, по сравнению с другими ферментами, связаны с более простым и дешёвым способом получения и очистки, низкой молекулярной массой, относительно высокой стабильностью при хранении, а также с наличием большого числа разнообразных хромогенных и флуорогенных субстратов[7].  
1.2.2Субстраты 
         Большое внимание при постановке ИФА обычно уделяется правильному выбору фермент-субстратной системы. Выбор той или иной фермент-субстратной пары для использования в конкретной тест-системе диктуется несколькими соображениями. Во-первых, обращается внимание на стабильность в процессе анализа и хранения как крайне чувствительного к структурным внутримолекулярным перестройкам конъюгата, так и во многих случаях светочувствительного хромофорного или флуорохромного субстрата. Во-вторых, это отсутствие используемого в диагностикуме фермента или субстрата (свободного или связанного) в биологических или клинических образцах, которые предстоит анализировать. В-третьих, наличие соответствующей регистрирующей аппаратуры (спектрофотометра или спектрофлуориметра). И, наконец, в-четвертых, выбор той или иной фермент-субстратной пары диктуется естественным желанием экспериментатора или клинициста иметь в руках систему, обладающую максимальной специфичностью и чувствительностью.  
          Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат специфична. Основные требования к субстрату: обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате; образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат; субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения. Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество[8]. 
          1.2.3 Антигены и антитела 
          АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочищенными и высокоактивными. Кроме того, АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант, чужеродностью и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные АГ вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций. Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые антитела могут быть поли - или моноклинальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими.    При низкой аффинности AT распад комплекса АГ-АТ приводит к удалению связанного АГ из системы. Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител (появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в испытуемых образцах). 
           Выделение и очистка антигена для создания диагностикума достаточно трудоемкий процесс. В настоящее время данные задачи решаются с помощью методов биотехнологии путем создания генноинженерных (трансгенных) бактерий или дрожжей, синтезирующих антиген в необходимых количествах. Иммунный ответ на введение одного антигена сопровождается синтезом антител, различающихся по структуре и функциональному предназначению. Это иммуноглобулины классов G, D, E, A, M, из которых первые три могут связать по две молекулы антигена, то есть двухвалентны, IgA – четырех- или восьмивалентны, IgM – десятивалентны. С учетом того, что антиген, используемый для иммунизации животного, содержит не одну, а несколько антигенных детерминант, можно представить, какое множество антител вырабатывается в организме на введение одного антигена. Такие антитела называются поликлональными. Они гетерогенны по сродству к антигенам. Их состав непостоянен и зависит от вида животного, его генетических особенностей и физиологического состояния.

Антитела получают в лабораторных условиях путем иммунизации следующих  животных соответствующим антигеном: мыши, морские свинки, кролики, овцы, козы, лошади. Пригодны куры: антитела после иммунизации выделяют из желтков  яиц.

Для очистки и стандартизации поликлональных антител используется аффинная хроматография. Однако даже такой способ очистки не позволяет полностью избавиться от гетерогенности препарата антител. Антитела с одной специфичностью, реагирующие с единственной антигенной детерминантой (моноклональные), получают методами клеточной инженерии путем гибридизации иммунокомпетентных B-лимфоцитов и клеток миеломных опухолей, способных к быстрому размножению, неограниченному числом делений (в отличие от большинства неопухолевых клеток, у которых число делений ограничено). Препараты моноклональных антител характеризуются постоянством состава и физико-химических свойств, низкой вероятностью перекрестной реакции с «чужими» антигенами. Это высокотехнологичный продукт. Его недостаток – зачастую сравнительно низкое сродство к субстрату, низкая аффинность. Одним из наиболее чувствительных методов выявления антител считается ИФА, который не уступает по чувствительности радиоиммунному анализу РИА и в то же время отличается от него большей доступностью для обычных диагностических лабораторий. Высокая чувствительность в сочетании с быстротой анализа (от нескольких минут до нескольких часов), возможностью одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствием особой необходимости предварительных операций по очистке и концентрированию анализируемого соединения в образце придают ИФА неоспоримые преимущества перед другими аналитическими методами[9].

1.2.4 Ферментный конъюгат

          Конъюгат - это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно.

          Однако антигены разнообразны  по своим физико-химическим свойствам  и строению, а значит невозможно  разработать универсальные методики  для получения конъюгата с  антигеном. Приготовление меченых  антител для ИФА методически более доступно. Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело. Наиболее широко распространённый метод приготовления иммунопероксидазных конъюгатов связан с обработкой фермента перйодатом натрия. При этом в результате окисления углеводной части энзима образуются активные альдегидные группы, которые вступают во взаимодействие с аминогруппами иммуноглобулинов. Чтобы обеспечить более стойкие типы связей в формируемых иммуноферментных комплексах, последние обрабатывают различными модификаторами. Для этой цели чаще всего используют боргидрид натрия[10].