Иммуноферментные тест-системы: общая характеристика, разработка и использование в практике микробиологических исследований

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами: высоким  антительным тигром и высокой  афинностью к антигену, чтобы его  можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание; достаточной специфичностью в рабочем разведении; преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции; оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1); достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате[11].

1.2.5 Твердая фаза

В качестве носителей иммунореагентов  при постановке твёрдофазных вариантов  ИФА применяют как органические, так и неорганические материалы. К числу первых относятся полипропилен, поликарбонат, полиметакрилат, поливинилхлорид, полистирол, нейлон, нитроцеллюлоза, кремнийорганические полимеры. Примером носителей второго типа являются оксиды различных металлов, кварц, пористое стекло.

Твёрдофазный носитель, предназначенный  для использования в системах гетерогенного ИФА, должен удовлетворять следующим основным требованиям: обладать выраженной связывающей способностью в отношении иммобилизуемого лиганда, иметь низкий уровень неспецифической адсорбции, характеризоваться высокой стабильностью своих свойств.

По заключению многих авторов, лучше других указанным критериям  отвечает полистирол. Из него путём  литья под давлением изготавливают  разные типы носителей: от микрочастиц  до пробирок и пластин. В повседневной лабораторной практике чаще всего применяют микропланшеты с плоскодонными лунками, в которых можно проводить весь цикл исследований от стадии иммобилизации иммунореагентов до измерения оптической плотности продуктов ферментативной реакции[12].

Из других носителей антигенов  и антител при постановке ИФА весьма распространёнными являются производные целлюлозы. Они гидрофильны, достаточно однородны, им несвойственно неспецифическое связывание. На них с помощью известных методических приёмов можно иммобилизовать большие количества иммунореагентов. Кроме того, из этих веществ легко изготовить соответствующие индикаторные полоски или мембраны разной толщины и плотности[13].

Свободные сайты на поверхности  твердой фазы, не связавшиеся с  сорбируемым агентом, могут фиксировать  в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала. Для предотвращения неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу основного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты - бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др. Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы[14].

          2 Иммуноферментные тест-системы

Теоретические и практические достижения современной науки значительно расширили методологический арсенал диагностики мониторинга. К одним из самых эффективных диагностических методов относится имммуноферментный анализ. С его помощью можно проводить  как массовые обследования, так и поставить окончательный диагноз[15].

          Последнее десятилетие стало периодом интенсивного развития и внедрения  в широкую микробиологическую практику иммуноферментных тест-систем и наборов. Их явные преимущества заключаются не только в высокой чувствительности и специфичности, но и в простоте применения и учета результатов, что существенно расширяет возможности их использования для проведения не только массовых, но и индивидуальных исследований. Внедряемые в практику простые и надежные высокочувствительные и специфичные тесты, созданные с использованием современных технологий и последних научных достижений, становятся основой лабораторных исследований[16].

2.1 Классификация ИФА тест-систем

          В зависимости от того, какие  антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяются на:

          1. Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре). Лизатные тест-системы относятся к тестам первого поколения, с их помощью выявляются все присутствующие антитела, но они обладают гиперчувствительностью и дают большое количество ложноположительных результатов. на стенки лунок пластикового планшета в лизатных тест-системах в качестве АГ иммобилизированы лизаты культуры лимфоцитов, зараженных возбудителем.

          2. Рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя; В рекомбинантных тестах используют белки возбудителя, полученные в прокариотах, за счет встраивания отдельных генов вируса или микроорганизма, отвечающих за синтез диагностически значимых белков. Эти тест-системы более специфичны, чем лизатные, но менее чувствительны.

          3. Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков. В пептидных тест-системах используют синтетические пептиды возбудителя заболевания, полученные путем биохимического синтеза высококонсервативных эпитопов вируса или бактерий. Пептидные тест-системы высоко специфичны, по обладают меньшей чувствительностью по сравнению с лизатными тестами. Существуют зарубежные тесты, иммуносорбенты которых содержат комплекс лизатных, рекомбинантных, пептитных антигенов.

          Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным[17].

Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы иммуногенными (то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам) и высоко специфичными (то есть, характерными лишь для данного возбудителя и, по возможности, не дающими перекрёстных реакций с антителами к другим антигенам)[18].

Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы  практически со 100%-ной специфичностью при высокой чувствительности.

На практике этого  не всегда удаётся достичь, однако специфичность  лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %[19].

2.2 Общая характеристика  иммуноферментных наборов

          Иммуноферментные тест-системы выпускаются  в виде многокомпонентных наборов, содержащих все реагенты, необходимые для проведения анализа, и инструкцию по их применению. В каждом диагностическом наборе содержатся положительный и отрицательный контрольные образцы, которые позволяют оценить качество набора и правильность проведения анализа. ОП в лунках с контрольными образцами должна соответствовать нормам, предусмотренным нормативно-технической документацией (НТД) на данную тест-систему и указанным в инструкции по применению диагностического набора. Только в этом случае набор считается пригодным к использованию, а полученные результаты состоятельными. К каждой партии наборов производителем должен прилагаться паспорт ОБТК на данную серию наборов, в котором отражается её соответствие требованиям НТД и основные контрольные показатели, полученные при выпуске тест-системы. Значительные отклонения получаемых контрольных значений ОП от паспортных свидетельствует либо об изменении качества наборов, либо о допущенных при постановке анализа ошибках. Хотя все ИФА-тест-системы построены по единой схеме, каждый набор имеет свои особенности. Различия могут заключаться в степени рабочего разведения образца (1:10, 1:100, 1:200), в подходе к определению критической оптической плотности, по отношению к которой оценивается результат реакции. Предоставляемые аналитические возможности отдельных тест-систем также могут быть различны.  Кроме того, различаться могут составы и способы приготовления используемых растворов, методические детали проведения анализа (число промывок планшета на каждой стадии, продолжительность инкубаций, условия хранения рабочих растворов и т.д.), поэтому при работе с любой тест-системой необходимо строгое соблюдение требований инструкции по её применению[20].

          2.3 Параметры, указываемые производителем при изготовлении тест-систем

          При изготовлении тест-системы  производитель должен указывать  следующие параметры:

• Принцип и количество стадий анализа, наличие твердой фазы;
• Назначение тест-системы;
• Основные компоненты: иммуносорбент, конъюгат, контрольные образцы, реагенты для подтверждающего теста (нормальная и иммунная сыворотка), промывающий раствор, разбавитель конъюгата, готовые к использованию жидкие формы конъюгата, окрашивающий комплекс (в России применяют ТМБ), контроли, стоп-реагент;
• Формат планшета (чаще 96-луночный, 12 стрипов по 8 лунок);
• Показатель чувствительности тест-системы;
• Объем исследуемого образца для внесения в лунку;
• Продолжительность анализа (суммарное время инкубаций);
• Цветовая индикация внесения сывороток, контролей и конъюгата в лунки планшета;
• Условия регистрации результатов (длина волны 450 нм для наборов с ТМБ, референс-волна – 620 нм);
• Условия транспортировки и срок годности набора. 
  В набор также должны входить разовые емкости для растворов, наконечники для пипеток, клейкая пленка для планшетов. 
  Обязательно наличие регистрационного удостоверения. В описании наборов должны быть указаны меры предосторожности при работе, приемы подготовки реагентов для анализа[21].

          2.4 Общие рекомендации к использованию наборов ИФА

1. Не использовать компоненты набора с истекшим сроком годности. Набор следует хранить при температуре, указанной в документации, прилагаемой к набору.
2. Во избежание конденсации влаги внутри лунок стрипов не извлекать планшет из пакета, пока его температура не достигнет комнатной.
3. Перед использованием тщательно перемешивать реагенты во флаконах. Отбирать из флаконов только необходимое количество реагентов. Никогда не сливать излишки реагентов обратно во флаконы во избежание контаминации. Закрывать каждый флакон своей крышкой.
4. Избегать перекрестного загрязнения реагентов. Для каждого реагента и исследуемого образца использовать новые сменные наконечники. Мыть руки до и после использования реагентов. Перекрестное загрязнение реагентов и/или образцов может привести к получению ложных результатов.
5. Вносить реагенты как можно  ближе ко дну лунки, но не касаясь наконечником поверхности, чтобы не повредить покрытия лунок.
6. Соблюдать указанные в инструкции режимы инкубации и промывки. Воспроизводимость в любом иммуноферментном анализе зависит от точности пипетирования, соблюдения времени и температуры инкубауии, соблюдения последовательности и количества промывок.
7. Коньюгат, а затем раствор субстрата и стоп-реагент рекомендуется вносить в лунки планшета с той же скоростью и в той же последовательности, что и калибровочные пробы, контрольную сыворотку и исследуемые образцы. Это необходимо для соблюдения примерно равного времени реакции во всех лунках.
8. Инкубацию с раствором субстрата следует проводить в темноте. Раствор субстрата чувствителен к свету, его следует предохранять от воздействия прямых солнечных лучей, чтобы не допустить окрашивания из-за аутоокисления. Флакон с раствором субстрата следует закрывать сразу после использования.
9. После добавления стоп-реагента в лунку с субстратным раствором смесь реагентов рекомендуется осторожно перемешать на шейкере или легким постукиванием по ребру планшета. Если в лунках после добавления стоп-реагента образовались пузырьки воздуха, перед проведением измерения на спектрофотометре осторожно удалить эти пузырьки запаянным или загнутым кончиком наконечника[22].

3 Разработка ИФА тест-систем

Все  разрабатываемые ИФА-наборы, предназначенные для выявления  специфических антител к соответствующему антигену или непосредственно для  выявления самого антигена, проходят широкомасштабные испытания в различных хозяйствах и регионах нашей страны и подлежат регистрации и сертификации.

При разработке тест-систем следует совершенствовать следующие  критерии: специфичность, чувствительность, воспроизводимость результатов, время проведения анализа, комплектация наборов и их срок годности.

Специфичность метода ИФА  высока за счет использования моноклональных АТ и рекомбинантных (или очищенных  АГ).

Чувствительность тест-систем для ИФА должна варьировать от 1 до 10 нг/мл анализируемого образца.

Коэффициент вариации при  исследованиях должен быть равен 2-8%.

Время проведения анализа  чаще всего составляет 3-4 часа с учетом всех проводимых процедур.

В комплектацию наборов должны входить все необходимые для  анализа компоненты, которые должны быть стандартизованы и готовы к применению.

Срок годности ИФА-набора должен составлять не менее 1 года при  соблюдении условий хранения.

          Целью разработки новых тест  – систем является оптимизация  данных критериев. Варьируемыми  параметрами при этом являются: концентрация конъюгата гаптена с ферментом, объем пробы, ее разведение и способ очистки, зависимость кинетики развития окраски от концентрации структурно близких веществ (время развития окраски при инкубации проб с субстратом), матричный эффект образца[23].

         3.1 Современные подходы к разработке ИФА тест-систем

За последнее десятилетие  произошли значительные изменения  в технологии производства ИФА-наборов, обусловленные результатами научно-практических разработок. Во-первых, моноклональные антитела (МкА) практически полностью вытеснили поликлональные не только в «сэндвич» вариантах ИФА, предназначенных для обнаружения антигена, но и в большинстве тест-систем, направленных на выявление антител, где они используются либо в качестве конъюгатов или для адсорбции антигена. Во-вторых, в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем эффективно используются  рекомбинантные антигены, обладающие иммунохимическими свойствами нативных белков и представляющие собой хорошо охарактеризованные и стандартизированные препараты. И, в-третьих, в качестве неспецифических компонентов тест-систем и наборов стали применяться стандартизованные микропанели,  стабильные химические реагенты и высокочувствительные субстратные смеси[24].

Явные преимущества таких тест-систем заключаются не только в высокой чувствительности и специфичности, но и в простоте применения и учета результатов, что существенно расширяет возможности их использования для проведения не только массовых, но и индивидуальных исследований. Внедряемые в практику простые и надежные высокочувствительные и специфичные тесты, созданные с использованием современных технологий и последних научных достижений, становятся основой лабораторных исследований.