Жалпы медициналық микробиология пәнінің зертханалық сабақтарына арналған оқу-әдістемелік құралы

6. Преципитация реакциясы мен оның варианттары. Преципитация реакциясы электролиттің қатысуында спецификалық ұсақ дисперсті антигендердің эквивалентті мөлшердегі анитденелермен  тұнбаға түсуімен сипатталады. Ерімейтін антиген-антидене кешенінің тұнба түрінде шөгуі ингредиенттердің эквивалентті қатынасы кезінде ғана байқалады, себебі, пайда болған кешен антигеннің немесе антидененің артық мөлшерінде еріп кетуі мүмкін. Антиген мөлдір коллоидты ерітінді сипатында болуы тиіс.  Инфекциялық аурулардың зертханалық диагностикасында преципитация реакциясы ең алдымен антиденесі (преципитині) бар белгілі преципитациялаушы сарысу бойынша антигенді (преципитиногенді) айқындауға немесе идентификациялауда жиі қолданылады. Преципитация реакцияларына қатысушы антигендердің коллоидты ерітінділерін дайындау үшін оларды зерттеу материалынан (жануарлардың терілері, жүндері, еттері) экстракциялауының әртүрлі әдістері қолданылады.

Преципитация реакциясы патологиялық материалдан, сыртқы орта объектілерінен немесе бактериялардың таза дақылдарынан экстрагацияланған мөлдір коллоидты ерігіш антигендерімен жүргізіледі. Реакцияда антиденелердің жоғары титрі бар мөлдір диагностикалы преципитациялаушы сарысулар қолданылады. Преципитациялаушы сарысудың титрі ретінде иммунды сарысумен әсерлескенде көзбен көрінетін преципитаттардың – лайсаңданулардың түзілуін туғызатын антигеннің ең үлкен сұйылтпасы қолданылады (кесте 10.1.1.).  

С а қ и н а л ы    п р е ц и п и т а ц и я   р е а к ц и я с ы   жіңішке  (0,5 см диаметрлі) түтікшелерде қойылады. Оларға 0,2-0,3 мл приципитациялаушы сарысуды ендіреді. Содан соң, Пастер тамызғышымен 0,1-0,2 мл антиген ерітіндісін баяулата қабаттап тамызады. Түтікшелерді абайлап тік қалыпта орнатады. Реакция нәтижесін 1-2 минуттан соң жүргізеді. Реакция оң нәтиже берген жағдайда сарысу мен зерттелетін антиген шекарасында ақ сақина түріндегі преципитат пайда болады. Бақылау түтікшелерінде преципитат түзілмейді (сурет 10.1.4.).

Г е л ь д е г і   п р е ц и п и т а ц и я   р е а к ц и я с ы. Табақшаларға агар құяды да бір-бірінен бірдей қашықтықта бірнеше оймақтар ойып алады. Орталық оймаққа антиденесі бар сарысуды енгізіп, қалғандарына әртүрлі зерттелуші антигендерді немесе әртүрлі сұйылтпадағы бір антигенді құяды. Агарлы гельдегі реагенттердің диффузиясы кезінде антиген мен антидененің аса қолайлы қатынастағы кездесу шегінде лайсаң жолақтар – преципитация доғалары пайда болады (сурет. 10.1.5).

 К е с т е 10.1.1. Преципитация реакциясын қою (хаттама қалыбы) 

Преципитация реакциясын әртүрлі сұйылтпалы антигендермен жүргізгенде преципитациялаушы сарысу титрін – сол сарысуда преципитация беретін антигеннің максимальді сұйылтпасын анықтауға болады. Гельдегі преципитация реакциясының алуан түрінің бірі зерттелетін бактерияның, мысалы дифтерия бактериясының токсигенділігін анықтауға мүмкіндік береді (14.2 тақырыпты қара). Токсигенді дақыл болған жағдайда токсиннің антитоксинмен әсерлесу орнында доға түріндегі преципитация сызығы пайда болады (сурет. 10.1.6).

7. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ). Иммуноэлектрофоретикалы талдама электрофорездің агарлы гельдегі иммунодиффузиямен үйлесімі түрінде беріледі. Алдымен агарлы гельде ақуызтардың электрофорезді даралануы жүргізіледі. Ақуызтардың миграциялану сызықтары параллель жүретін орларға бөлуден соң, преципитациялаушы иммунды сарысуды енгізеді. Гельде антиген мен антидене бір-біріне қарай дифузияланады да, олардың кездесу орнында доға тәріздес преципитация сызықтары пайда болады, олардың саны, орналасуы және пішіні арқылы антигеннің бастапқы қоспасының құрамы туралы тұжырым жасауға болады. ИЭФ – антигендердің сапалы талдамасын жасаудағы кеңінен тараған әдістердің бірі. Сәйкес преципитациялаушы антисарысулар қолда барда, оның көмегімен кез-келген антигенді қоспаны зерттеуге болады. Атап айтқанда, қан сарысуының, жұлын сұйықтығының, зәрдің, сүттің, мүшелерден алынған экстрактілердің ақуызтары, және де өсімдіктер мен бактериялардан шыққан ақуызтар табысты түрде талдамалануда.

                                Сурет. 10.1.4. Преципитация реакциясы

1 – преципитациялаушы сарысу + зерттелуші материал; 2 – преципитациялаушы  сарысу + гомологиялық преципитиноген; 3 – преципитациялаушы сарысу + антигенсіз  бақылау экстрактісі; 4 – преципитациялаушы  сарысу + натрий хлоридінің изотоникалы ерітіндісі; 5 – қалыпты сарысу + зерттелуші антиген; 6 – қалыпты сарысу + антигенсіз бақылау экстрактісі.

Сурет. 10.1.5. Оухтерлони бойынша гельдегі    Сурет. 10.1.6. Агардағы преципитация реакция-       преципитация реакциясы                                         сындағы дифтерия коринебактериясының

                                                                                     токсигенділігін анықтау.

      8. Гемагглютинацияны  тежеу реакциясы. Вирустарды типтеу типоспецификалық сарысулар жиынтығымен қоса гемагглютинацияны тежеу реакцияларында (ГАТР) жүргізіледі. Гемагглютинацияның болу-болмауы бойынша реакция нәтижесін ескереді. H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 антигендері бар  А гриппы вирусының типастылары гомологиялық типоспецификалы сарысулар жиынтығы бар ГАТР-мен дифференцияциялануы мүмкін (кесте. 10.1.2, 10.1.3).

Кесте 10.1.2. Вирустарды типтеу үшін ГАТР-ын қою

Кесте 10.1.3. Грипп вирусын типтеудегі ГАТР нәтижелері

Шартты белгілері: (+++) – қабыршақтағы саңлаулар жинағы; (++) – жабысудағы эритроциттерден пайда болған шашақты жиектері бар қабыршақ жинағы; (+) - агглютинацияланған эритроциттердің түйірлері аймағымен қоршалған эритроциттердің үлпілдек тұнбасы; (–) – бақылаудан айырмасы жоқэритроциттердің күрт шектелген тұнбасы.

Тақырып 10.2. СПЕЦИФИКАЛЫ АНТИДЕНЕЛЕРДІ САНДЫҚ АНЫҚТАУ

                            ӘДІСТЕРІ (СЕРОДИАГНОСТИКА).

Қан сарысуындағы спецификалы антиденелердің санын олардың спецификалы антигендермен байланысуын тікелей айқындау әдістерімен анықтауға болады. Қазіргі уақыттағы едәуір жетілген екі серологиялық зерттеу әдістері: радиоиммунды және иммуноферментті әдістер. Қандай жағдайда да белгілі тазартылған антиген қажет. Оған радионуклидті немесе ферментті таңба бекітіледі. Орайында, таңбаланған антигеннің антиденемен байланысуы радиометриялық немесе спектрофотометриялық әдістермен ескеріледі.

Антигеннің антиденемен байланысуын тікелей айқындау әдісінен бөлек, антиген қасиеттерінің өзгеруіне негізделген серологиялық әдістер қолданылады: агглютинация, преципитация, иммунды лизис, комплемент байланыстыру, нейтрализация реакциялары.

 Әдістемелік нұсқаулар

Сарысу дайындау үшін көктамырдан 3-4 мл мөлшерде алынған қанды 10-15 минут 37°С-та термостатқа орналастырамыз. Қан ұйыған соң шыны түтікше қабырғасындағы қойыртпақтарды шыны таяқшамен ысылдырып, қойыртпақтың жақсы реакциясы мен сарысудың толық бөлектенуі үшін бір сағат бойы 4°С-та ұстайды. Сонан соң, сарысуды тамызғышпен абайлап ысылдырып алады.

1. Радиоиммунды әдіс. Зерттелуші үлгідегі спецификалық антиденелердің мөлшерін конкурентті байланысу варианттарын пайдалану арқылы анықтауға болады, мысалы, радиоактивті таңбаланған антиденелердің қатты фазада бекіндірілген спецификалы антигендермен байланысуын ингибирлеуге қабілеттілігі бойынша. Бірақ, көбінесе, иммуноглобулин молекуласының константалы аймағына спецификалы болып келетін радиоактивті таңбаланған антииммуноглобулинді антиденелердің көмегімен қатты фазада антигенмен байланысқан спецификалы антиденелерді айқындау әдісін қолданады. Бәрінен қарапайымдысы жануарлардың бір түрінің иммуноглобулиндерін екінші жануар түріне егу арқылы антииммуноглобулинді сарысу алу. Мұндай антииммуноглобулинді сарысу ұқсас түрлердің (тышқандардың, қояндардың және басқа түрлердің) кез-келген иммуноглобулиндерінің молекулаларын байланыстыра алады. Адам иммуноглобулиніне қарсы радионуклидтермен таңбаланған мұндай антииммуноглобулинді сарысуды РИА-де таңбаланбаған адам антиденелерінің бекіндірілген антигенде байланысуын айқындау үшін пайдаланады. Бұл антиммуноглобулинді сарысу антигендік эпитоптармен байланыса отырып, молекулалардың константалы бөліміндегі әртүрлі спецификалы антиденелерді "таниды".

РИА-ді немесе ИФА-ді пайдалана отырып, антигенспецификалы антиденелердің мөлшерін ғана емес, сол антиденелердің қандайда бір иммуноглобулин изотиптеріне тиесімділігін де анықтауға болады. Ол үшін иммуноглобулиндердің жекеленген изотиптері үшін спецификалы болып келетін антииммуноглобулинді антиденелер қолданылады. Мұндай антииммуноглобулинді антиденелерді бөліп алу жануарды нақты бір иммуноглобулиндер изотипінің тазартылған препаратымен иммунизациялаудан басталады. Алынған иммунды сарысудан көпмәртелік абсорбциялау жолымен басқа изотип иммуноглобулиндермен қиылыса әсерлесетін барлық антиденелерді шығарып тастайды. Алынған антиизотипті антиденелерді иммунды сарысудағы әрбір изотиптердің антигенмен әсерлесуші антиденелер санын анықтау үшін пайдаланады. Ерекше рольді IgE-ге қарсы антиденелер атқарады, олар анафилактикалық типті аллергиялық реакциялар мен атопиялық аурулардың зертханалық диагностикасында осы изотип иммуноглобулиндерінің және осы изотипке жататын спецификалық антиденелердің мөлшерін анықтауға мүмкіндік береді.