Жалпы медициналық микробиология пәнінің зертханалық сабақтарына арналған оқу-әдістемелік құралы

Жағынды-жұқпа дайындау үшін бауырдан, талақтан және бүйректерден  азғантай түйір кесіп, оларды пинцетпен алып, кесілген бетімен бұйым шынысына жұқтырады. Жағынды-жұқпаларды сұйық бекіндіргіште бекіндіреді де метилен көгімен бояйды. Микроскоппен көру кезінде әртүрлі мүшелер мен тіндердан  микроб-қоздырғышын іздейді. Себінді нәтижелерін термостатта инкубациялаған соң келесі күні ескереді. Мәйіттің сойып-ашу мәліметтерін хаттамалайды. Зерттеу біткен соң жануар мәйітін толық жояды.

 

Сурет 9.1.2. Тышқанды сойып ашу.  а-г – сойып ашу кезеңдері

 

Ж а н у а р л а р   м ә й і т і н   б а к т е р и о л о г и я л ы қ   з е р т т е у. Жануардың өлімін тудырған микроорганизмді табу үшін және олардың ағзадағы орнығуын анықтау мен қоздырғыштың таза дақылын алу үшін залалданған жануарды өле салысымен сойып-тіледі. Бөгде бактериялармен залалдануының алдын-алу үшін асептика ережелерін сақтау керек. Тышқанды табақша ішінде қатқан парафин беткейіндегі дезинфекциялаушы ерітіндіге шыланған дәкеге шалқасынан жатқызады да аяқтарын кере түйреуішпен түйрейді. Қандайда-бір антисептик ерітіндісімен терісін жақсылап өңдейді. Сойып-тілуді стерильді аспаптармен жасайды (9.1.2 сурет).          

  Терісін жақ астынан шатқа  дейін ұзына бойы, қолдан қолға  және аяқтан аяққа дейін көлденең  тіледі. Тері қиықтарын шеткері  айқарады. Тері асты май торшалары мен лимфа түйіндерінің жағдайын байқайды да, қажет болса, олардан жағынды-жұқпа мен себулер жасайды.

      Кеуде қуысын төстің  қылыш тәрізді өсіндісі астымен  көлденең және қабырға арқылы  кеудеге ұзына бойы кесе отырып, ашады. Кесілген қиықтарды айқарып, кеуде қуысының мүшелерін қарайды да, эксудаттың бар-жоқтығын хаттамаға белгілейді. Жүректен қан алып себу жасау үшін оның беткейін от жалынына қақталған пинцет ұшымен күдіреді де, сол жер арқылы жүрек қуысына стерильді тамызтқыш капиллярын ендіреді. Содан соң тамызтқыштағы қан тамшысын қоректік ортасы бар түтікшеге үрлейді. Өкпе ұлпасынан жағынды-жұқпа дайындайды және себулер жасайды.

      Іш қуысын ішектерге  тигізбей, ұзына бойы қайшымен  кеседі. Іш қуысының мүшелерін  қарайды да, эксудаттың болуын, бауырдың, көк бауырдың, бүйрекүсті бездерінің, шажырқай лимфа түйіндерінің көлемін, қоюлық дәрежесін және  түсін хаттамаға тіркейді. Қажет болған жағдайда бұл мүшелерден  қоректік орталарға себулер жасайды.

 

 

Тарау 10     ҚОЛДАНБАЛЫ ИММУНОЛОГИЯ

 

Қазіргі заманғы фундаментальді иммунологияның жетістіктері иммунодиагностика, иммунопрофилактика, иммунотерапия және иммунокоррекция мәселелерімен айналысатын қолданбалы иммунология саласында қолданылуына себепкер болып отыр. Иммунодиагностика бірқатар әртүрлі диагностикалық мәселелерді шешеді: ағзаның иммунды статусын бағалау, спецификалық антигендерді айқындап идентификациялау, қан сарысуындағы және басқа да биологиялық сұйықтықтардағы спецификалық антиденелерді айқындап, оларды сандық анықтау (серодиагностика), нақты бір антигенге жасушалық немесе гуморальдіқ спецификалық жауаптың тиімділігін бағалау. Иммунотерапия -  пассивті иммунитет жасау жолымен нақты бір аурудың емдеуі немесе шұғыл профилактикасы мақсатында иммунды сарысуларды немесе иммуноглобулиндерді қолданумен айналысатын, ал дәлірек айтқанда – ағзаға токсиндерді немесе вирустарды нейтрализациялауға қабілетті дайын антиденелерді ендіріп, қоздырғышқа қарсы спецификалық қорғанысты қамтамасыз етумен айналысатын иммунология саласы. Сирек жағдайда созылмалы ауруларды емдеу мақсатында вакциналық препараттарды да қолданады. Вакциналар мен анатоксиндер адам ағзасында нақты бір антигенге қарсы меншікті белсенді иммунитет пайда болуына түрткі болатын иммунопрофилактиканың арсеналын құрайды. Науқастың қандай да бір иммунопатологиясы айқындалғанда иммунокоррекция мақсатында иммунодепрессанттар мен иммуностимуляторлар  препараттары қолданады:

 

 

Тақырып 10.1. СПЕЦИФИКАЛЫҚ  АНТИГЕНДЕРДІ АЙҚЫНДАУ

                            МЕН  ИДЕНТИФИКАЦИЯЛАУ

 

Антиген мен антидененің спецификалығы және байланысу беріктігі микроорганизмдер мен олардың өнімдерінің, ағза жасушаларының, тіндерының және биологиялық сұйықтықтарының құрамындағы антигендердің молекулаларын айқындап, идентификациялау үшін антиденелерді қолдануға мүмкіндік береді. Ол үшін белгілі бір спецификалылығы бар таңбаланған антиденелерді сәйкес антигендердің орнығу орындарымен тікелей байланыстыру әдістерін қолдануға болады. Антиденелерді таңбалау үшін флюоресцентті, ферментті немесе радионуклидті әдістер қолданылады. Беткейінде өзгермеген эпитоптары бар антиденелермен байланысуға мүмкіндік беретін антигендердің нативті құрылымы міндетті түрде сақталған болуы тиіс (сурет 10.1.1). Антигендерді айқындап, идентификациялау әдістерінің басқа да бір тобы – серологиялық реакциялар. Олар спецификалық антиденелермен байланысқа түскен соң антиген қасиеттерінің өзгеруімен айқындалады. Мысалы, жасушалардың желімденуі, коллоидты ерітіндіден тұнбаға түсуі, улылығын жоғалтуы, қозғалғыштығын жоғалтуы т.б.

Осы әсерілерге байланысты антиденелердің мынадай түрлері ажыратылады: агглютининдер (антигендерді алып жүруші жасушалардың аггрегациясын тудырушылар), преципитиндер (ерігіш антигендермен тұнбалар, преципитаттар түзушілер), лизиндер (жасушалық мембраналардың бұзылуын тудырушылар), антитоксиндер (токсиндерді нейтрализациялаушылар).

 

Сурет 10.1.1. Антигеннің антиденемен байланысу спецификалыылғы:

                        анитген эпитопының антидене  паратопымен.

 

▲ Әдістемелік нұсқау

     1. Иммунофлюоресцентті  талдама. Жасушалар мен тіндерда антиденелердің антигендермен байланысуын айқындаудың едәуір сезімтал әдістерінің бірі – иммунофлюоресцентті талдама. Арнайы флюоресцентті бояғыш (флюрохром) спецификалы антиденеге оның спецификалығын бұзбастан химиялық байланыспенен бекінеді. Көбінесе сарғыш-жасыл флюоресценцияға ие изотицианат флюоресцин бояғышын пайдаланады. Иммунофлюоресцентті әдіске таңдалынған бояғыштар бір толқын ұзындығы жарығымен (көбінесе – спектрдің ультракүлгінімен) активтенеді, ал өздері басқа толқын ұзындығы сәулесін (көрінетін спектр) шығарады. Люминесцентті микроскопта люминесценцияны қоздырушы жарық көзі ретінде окулярға тек флюоресценциялаушы бояғыш жарығын жіберетін селектівті сүзгі жүйесі бар сынап шамы қолданады. Әртүрлі бояғыштарды әртүрлі антиденелерге бекіндіре отырып, біруақытта жасушадағы бірнеше антигендерді айқындауға болады.

Иммунофлюоресцентті әдіс зерттелетін материалдағы белгісіз микроорганизмді жылдам айқындау және идентификациялау үшін таңдау әдісі болып табылатындықтан оны экспресс-диагностика әдісі деп атайды.

Тікелей иммунофлюоресценция әдісінің кемшілігі әрбір зерттелетін антигенге қарсы флюоресценциялаушы спецификалық антиденелердің үлкен жиынтығын дайындау қажеттілігінде. Сондықтан, көбінесе тікелей емес иммунофлюоресценциялаушы әдіс қолданады. Онда спецификалық (таңбаланбаған) антиденелермен байланысқан антигендер антиген-спецификалы антиденеге тиесілі түрдің иммуноглбулиндеріне қарсы флюоресценциялаушы антиимуноглобулинді антиденелердің көмегімен айқындалады.

Кейде қарапайым жарықтық микроскоппен көруге болатын иммуногистохимиялық әдіс те қолданылады. Мұнда спецификалық антиденелерге оларды боялған ферментативті ыдырау өнімдеріне айналдыруға қабілетті түссіз субстратты фермент, (мысалы, хрен периоксидазасы) жабысады.

Электронды микроскопияда антиген-спецификалы антиденелерді қолдану үшін алтын бөлшектерімен таңбалауға болады, сонда алтынның орнығуы арқылы сәйкес антигенді де табуға болады.

Кунстың  т і к е л е й  имунофлюресцентті әдісінде препараттарды люминесцентті микроскоппен көру кезінде спецификалық флюорсценциялаушы антиденелер микробтық антигендермен жарқырайтын кешендер түзеді.

         

Сурет. 10.1.2. Кунстың иммунофлюоресцентті әдісі.

а – тікелей әдіс; б – тікелей емес әдіс; АГ – антиген, АД – антидене, АГС – антиглобулинді сарысу.

Бұйым шынысы беткейінде зерттелетін материалдан жағынды дайындап, оны от жалынында бекінтеді да қоздырғыш антигеніне қарсы антиденелері бар қоянның иммунды сарысумен өңдейді. Антиген-антидене  кешені түзілу үшін препаратты ылғалды камераға орналастырып, 15 минут бойы 37°С-та инкубациялайды. Одан соң, антигенмен байланыспаған антиденелерді шығарып тастау үшін натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісімен мұқиат шаяды.

Сонан соң, препаратқа қоян иммуноглобулиніне қарсы флюоресценциялаушы антиглобулинді сарысуды ендіреді де, 15 минут бойы 37°С-та инкубациялап, натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісімен мұқиат шаяды. Флюоресценциялаушы антиглобулинді сарысудың антиген беткейінде бекіндірілген спецификалық антиденелермен байланысуы нәтіежесінде люминесцентті микроскопияда байқалатын жарқыраған антиген-антидене кешені түзіледі.

     2. Иммуноферментті  талдама. Тәжірибеде кеңінен тараған әдіс – иммуноферментті талдама (ИФА) – бастапқы антиген құрамындағы екі әртүрлі антигенді эпитоптарға қарсы екі спецификалығы бойынша әр түрлі моноклональді антиденелерді қолдануға негізделген. Бір эпитопқа қарсы иммобилизацияланған антиденелері бар оймақтарға құрамынан антиген іздеп отырған материалды қосады. Қатты фазадағы инкубация үрдісінде антиген-антидене кешені түзіледі. Сонан соң оймақтарды байланыспаған компоненттерден шаяды да, сол антигеннің басқа эпитопына қарсы таңбаланған (ферментпен) антиденені қосады. Қайталап инкубациялаудан және антиденелердің ферментпен артық конъюгаттарын шаюдан соң, байланысқан антиденелердің мөлшерін субстраттың индикаторымен байланысуындағы олардың ферментативті активтілігі арқылы анықтайды. Бұл кезде ферменттің белсенділік өлшемі зерттелетін антиген концентрациясына пропорционал. Иммундық кешенді айқындау сатысында антиген дәлірек айтқанда иммобилизацияланған және таңбаланған антиденелер молекулаларының арасында қысылған күйде қалады. Бұл әдебиетте кеңінен тараған "сэндвич" - әдіс атауына себепкер болды.

Иммуноферментті талдаманың спецификалығы мен сезімталдылығының жоғарылауы, иммунофлюоресцентті және радиоиммунды әдістердегідей, моноклональді антиденелерді (МКАД) қолданумен байланысты.

МКАД алу үшін антигеннің тазартылған препаратымен тышқандарды иммунизациялайды да көкбауыр мен лимфа түйіндерінен лимфоциттерді бөліп алып, олардың миеломды жасуша-партнерлермен қосылуын жүргізеді. Қосылмаған миеломды жасушалар өледі, өйткені олардың кейбір нуклеотидтерді синтездеуі бойынша ақауы бар және де осы нукеотидтерсіз селективті ортада өмір сүре алмайды. Қосылмаған лимфоциттер ортада өздеріне қажетті трофикалық факторлардың болмауына байланысты жойылады. Аман қалатыны тек миеломды жасушалардан дақылда пролиферациялану қабілетін, ал лимфоциттерден сәйкес спецификалығы бар антиденелерді синтездеу қабілетін мұрағаттап алған гибридті жасушалар (гибридомалар) ғана. Гибридомалар дақылдарының тұнба үстілік сұйықтығын сәйкес антигендермен ИФА көмегімен зерттейді. Керекті антиденелерді секрециялаушы жасушаларды айқындаған соң оларды лимитациялаушы сұйылту әдісімен  клондайды, яғни жасушаларды бір жасушадан жаңа жас дақыл алатындай етіп өсіріп-өндіреді. Сонда барлық ұрпақ генетикалық тұрғыда ұқсас болады: бір жасуша МКАД өндіретін бір клон береді.

3. Радиоиммунды талдама.  Радиоимунды талдама (РИА) кез-келген антигенді сандық тұрғыда анықтауға қолдануға болатын мейлінше сезімтал әдіс болып табылады. әдістің сезімталдылығы антигендердің мардымсыз санын анықтауға да мүмкіндік береді.

Сұйықтықтық радиоиммунды талдаманы жүргізу үшін тазартылған белгілі антигенді радионуклидтермен, көбінесе 125І-пен таңбалайды. Бұл жағдайда байланысудың конкурентті вариантын қолданады, яғни зерттелуші үлгідегі антиген мөлшерін анықтау үшін оның спецификалық антиденелермен байланысуда таңбаланған референс-антигендермен конкуренциялануға қабілеттілігін бағалайды.  Түзілген антиген-антидене кешенін тұндыру арқылы (амоний сульфатымен немесе антиденелермен) бөліп алып, оның радиоактивтілігін тұнба үстілік сұйықтықтағы байланыспаған антидененің радиоактивтілігімен салыстыра анықтайды. Таңбаланбаған антигендердің бірқатар концентрациясын пайдалану стандартты калибрлік иректі құрауға мүмкіндік береді. Оның көмегімен зерттелетін антигеннің концентрациясын анықтайды. 

Едәуір жаңарған әдіс – қатты фазалы РИА, онда спецификалық антиденелер қатты фазада бекіндіріледі, оларға зерттелетін антигенді артынан таңбаланған стандартты антигенді қосады. Байланысқан және байланыспаған таңбаларды анықтау калибрлік иректі құрауға және зерттеллетін антигендер санын анықтауға мүмкіндік береді.

РИА әртүрлі заттардың сандық анықтауларында кеңінен қолданылады: мысалы, гормондардың (инсулин, өсу гормоны, аденокортикотропты гормон, трийодтиронин, тироксин, эстроген), қан сарысуы ақуызтарының (IgE, α-фетопротеин, т.б.), метоболиттердің (фолий қышқылы, циклдік нуклеотидтер, т.б.), дәрілік заттардың (дигоксин, дигитоксин, морфин), микробтық антигендердің (HВsAg).

4. Агглютинация реакциясы. Инфекциялық аурулардың зертханалық диагностикасында диагностикалық агглютинациялаушы сарысулардың көмегімен бактериялардың түрлері мен сероварларын идентификациялау үшін агглютинация реакциясын қолданады. Шыныдағы агглютинация реакциясы (пластинкалық АР) титріне байланысты 1:10, 1:25, 1:50 немесе 1:100 құрайтын диагностикалық агглютинациялаушы сарысудың бір сұйылтпасымен қойылады.

Бұйым шынысын балауыз қаламымен квадраттарға бөледі. Бір квадратқа натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісін, екіншісіне – сарысу тамшысын тамызады. Сонан соң, құрықпен әрбір тамшыға бактериялық дақылдың азғантай мөлшерін ендіріп, біртекті қойыртпақ пайда болғанша айналдыра араластырады. Шыныны от жалынында жоғары ұстап, 2-4 минут аралығынджа аздап қыздырса реакция жылдам жүреді. Тамшыда агглютинаттың түйіршіктері мен үлпектері пайда болуы байқалады. Нәтижелеу 3-5 минуттан соң жүргізіледі (10.1.3.).

Бактериялардың антиденелермен туындаған спецификалық агглютинациясынан бөлек, спонтанды агглютинация да (иммунды сарысудың жоқтығында) жүруі мүмкін. Спонтанды агглютинацияны натрий хлоридінің изотоникалы ерітіндісінде гомогенді қоспа түзбейтін және жасушалық аггрегат түрінде тұнбаға түсетін R-формалы бактериялар береді. Ортаның қышқыл реакциясы кезінде бактериялық жасушаның беткейінен біртекті зарядтың түсуі нәтижесінде изоэлектрикалы аймақта да желімдену жүреді, яғни "қ ы ш қ ы л д ы қ" агглютинация басталады. Спонтанды агглютинацияның жалған нәтижелерін есетеп қою мүмкіндігінен арылу үшін әрдайым натрий хлоридінің изотоникалы ерітіндісімен бақылау сынамасын қояды.

 

     

Сурет 10.1.3. Шыныдағы агглютинация реакциясы.

а – агглютинация бар; б – агглютинация жоқ.

 

5. Тікелей емес гемагглютинация реакциясы. Тікелей емес гемагглютинация реакциясы (ТЕГАР) агглютинация реакциясымен салыстырғанда едәуір жоғары спецификалығымен және сезімталдылығымен ерекшеленеді. Оны қоздырғышты антигендік құрылымы бойынша идентификациялау үшін немесе зерттелетін патологиялық материалдағы бактериялық токсиндерді индикациялау мен идентификациялау үшін қолданады. Осылайша  спецификалық антиденелерді танизацияланған (танинмен өңделген) эритроциттер беткейінде адсорбциялау жолымен алынған стандартты (коммерциялы) эритроцитарлы антиденелік диагностикумдарды да қолданады. Пластмассалы пластиналардың оймақтарында зерттелу материалының кезектемелі сұйылтпасын дайындайды. Сосын әрбір оймаққа антиденелермен толастаған эритроциттердің 3%-ті суспензиясының біркелкі көлемін ендіреді. Қажет болған жағдайда реакцияны әртүрлі топтық спецификалыққа ие антиденелермен толастанған эритроциттері бар бірнеше қатар оймақтармен параллель жүргізуге болады. 37°С-та 2 сағат инкубациялаған соң эритроциттер тұнбасының сыртқы көрінісін (сілкілемей) бағалай отырып, нәтижесін ескереді: теріс реакция кезінде жинақы диск түрінде тұнба немесе оймақ түдінде сақина түзіледі, ал оң реакцияда – эритроциттердің өзіне тән айналмалы тұнбасы, жиегі тегіс емес жұқа қабықша пайда болады.