Жалпы медициналық микробиология пәнінің зертханалық сабақтарына арналған оқу-әдістемелік құралы

 

       Сальмонеллаларды  анықтау үшін зерттелуге алынған  азықтың ілмесі 25 г-нан кем болмау  керек. Ілме сұйылтпаларының себінділерін 100 мл байыту орталарында (Мюллер, Кауфман) жасайды да, 24 сағатта инкубациялайды. Сырғымалы өсудің байқалуы Proteus spp. бар екендігінің айғағы. Жағындылардан грамтеріс таяқшаларды айқындайды,  олардың қозғалысын анықтаған соң бактериялар дақылын идентификациялайды. Коагулазаоң стафилококктарды анықтау үшін  азық қоспасының 0,2 мл-ін сарыуызды-тұзды агарға себеді, себіндіні 37 °С бөлме температурасында инкубациялайды. Стафилококк анықталған жағдайда идентификациясын жүргізеді (12.1 тақырыпты қара). Анаэробты споратүзуші бактерия - Clostridium perfringens-ті табу үшін қоспаның 10-мәртелік сұйылтпасын сульфитциклсеринді ортаға (СЦО) және Вильсон-Блер ортасына себеді. Себінділерді 46°С термостатта 12 сағат инкубациялайды; ортаның қара түске ие болуы Clostridium perfringens бар екендігі. Себудің 10-1 сұйылтпасында оң нәтиженің байқалуы азықтың 1граммында 10 бактериялық жасуша бар екендігіне меңзейді, ал 10-2 де байқалса 100 жасуша және т.с.

Шұжық өнімдері мен еттен жасалған тағамдар құрамында заң күшіндегі нормативтерге сәйкес ІТТБ (1г тағамда), сальмонеллалар (25г-ында), Proteus туысының бактериялары мен сульфитредуцирлеуші клостридиялар (0,1 г-ында) болмауы қажет; микроб саны 103 –нен аспауы қажет.

Консервлердің санитарлы-бактериологиялық зерттеуі. Консервлерді зерттегенде анаэробты және аэробты бактериялардың бар-жоқтығын анықтайды. Эпидемиологиялық көрсеткіштер бойынша Clostridium botulinum-ді анықтайды да, ботулиндік токсиннің бар-жоқтығына зерттеу жүгізеді. Бактериологиялық зерттеу алдында консервлік банканы ыстық сулы ыдыста герметикалық бүтіндікке тексереді, 37 °С термостатта 5 тәулік бойы ұстап, бомбажға бақылау жасайды. Сонан соң, жылы сумен жуып, кептіріп, спиртпен сүртеді де беткі қақпағын от жалынына қақтайды. Банкіден алынған тағамды аэробты флораны анықтау мақсатында сорпа құйылған екі түтікшеге, анаэробты микрофлораны анықтау мақсатында 0,15 % агарлы Китто-Тароцци ортасы бар екі түтікшеге себеді. Себінділерді 37°С термостатта 5 тәулік инкубациялайды.  Аэробты бактериялардың өсу белгілері байқалған жағдайда қоректік агарға, Эндо ортасына, қиғашталған агарға (Щукевич бойынша), 1 % глюкозалы қоректік агарға ауыстыра себу жасайды. Китто-Тароцци ортасынан 1-2 мл алып, Петри табақшасына ендіреді де үстіне балқытылып 45-48°С-қа суытылған  1 % глюкозалы қоректік агар құяды. Қоректік орта қатайған соң оның беткейіне стерильді бұйым шынысын орналастырады (анаэробты жағдай туғызу үшін) да, себіндіні 37°С термостатта 1 тәулік инкубациялайды. Өсіп-өнген колониялардан таза дақыл алып, әдеттегі схема бойынша идентификациялайды.  

Ботулиндік токсинді айқындау үшін консервілердің зерттелуші сынамаларын сүзгілейді.  Сүзінді  мен A, B, C, D, E, F типті антитоксикалы ботулизмге қарсы сарысуды ақ тышқандарға еге отырып, нейтрализация реакциясын қояды немесе токсиннің бар-жоқтығын басқа да серологиялық реакциялармен (мысалы,  иммуноферментті талдамамен) анықтайды. Консервілерде Clostridium botulinum мен оның токсиндерінің, Clostridium perfringens-тің және басқа да патогенді бактериялардың болмауы тиіс.

Аэробты спора түзбейтін флораның анықталуы, қолданылған консервлеу әдістерінің талапқа сай болмағандығын және тағамның бұзылғандығын көрсетеді. Сапрофитті аэробты бациллалардың  (Basillus subtilis, Basillus mesentericus) анықталуы консерві банкілерінің герметикалығы сақталған және бомбажы  болмаған  жағдайда жарамсыздыққа саналмайды.

Санитарлы-бактериологиялық зерттеулерден бөлек, азақ-түліктердің құрамындағы басқа да токсикалық заттарға бақылау жүргізіледі: микотоксиндерге – дәнді дақылдарды, ірімшіктерді, көк-өністеді, жеміс-жидектерді; антибиотиктерге – етті, құстар етін, жұмыртқаны, сүттерді; консерванттарға – сүт, ет, көк-өніс өнімдерін, сусындарды; пестицидтерге – дәнді дақылдарды, көк-өністерді, жеміс-жидектерді тексереді.

 

 

Тақырып 8.3.  АДАМ АҒЗАСЫНЫҢ МИКРОФЛОРАСЫ

 

▲   Әдістемелік нұсқаулар

        Микрофлора  құрамын сапалық тұрғыда түйсіну  үшін микроскопиялық және микробиологиялық зерттеу әдістерін қолданады. Препараттарды (жағындыларды) тіс өңезінен, көмейдің кілегейлі қабықшасы шайындысынан дайындайды, оларды Грам әдісімен бояп, микроскоптайды (сурет 8.3.1).  Тіс өңезінен тірі препараттар дайындауға ("жаншылған" тамшы) және күнгірт-жазықтық немесе фазалы-контрастық микроскопия көмегімен қозғалмалы бактерияларды айқындауға болады. Микробиологиялық зерттеулер үшін беттің,  қолдың және дененің басқа да бөліктерінің терісінен натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісінде шыланған тампонмен шайынды алады. Одан соң, сол тампонмен Петри табақшасындағы қоректік агарға себу жасайды. Сонымен қатар, жеке бір тампонды ІТТБ анықтау үшін глюкозапептонды ортасы бар түтікшеге  (орта құрамын 8.1 тақырыптан қара) орналастырады.

        Сурет 8.3.1. Тіс өңезінің микрофлорасы.

1 - Leptotrichia spp.  (L.buccalis) (ұзарған немесе жіпше тәрізді грамтеріс бактериялар); 2 - Lactobacillus spp. (L.acidophilus, Lsalivarius және т.б.) 3,4 – Treponema spp. (T.denticola, T. Skoliodontum және т.б.) 5. Streptococcus spp. (S.salivarius6 S.mitis, S.sanguis және т.б.) (Грамоң кокктар) 6.Veilonella spp. (V.atirica) (грамтеріс диплококктар) 7. Fusobacterium spp.(F.nucleatum және т.б.) (грамтеріс бұрама тәріздес бактериялар).

Микробтардың жуық шамалық идентификациясын өскен колониялар сипаты, глкозапептонды ортада газ түзілуі және Грам әдісімен боялған жағындылардағы жасушалар морфологиясы  бойынша жүргізеді. Сандық анықтау себінділері үшін зерттелуші материалдың белгілі-бір көлемін (мысалы, көмейден кілегей) немесе белгілі-бір ілмесін (мысалға, нәжіс) алып, оны натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісінде (бактерияның жорамалдағы концентрациясына байланысты) сұйылтады да сәйкес сұйылтпалардан  қоректік орталарға себу жасайды: гемолитикалық стрептококктар мен стафилококктарды айқындау үшін – қанды агарға, E. Coli-ді бөліп алу үшін – Эндо ортасына, Candida туысы саңырауқұлақтарын бөліп алу үшін – Сабуро ортасына себулер жасайды. Себулерді кейін колонияларды санауға болатындай етіп жүргізеді. Ауру динамикасында микрофлора құрамының сандық өзгеруі туралы қорытынды жасау үшін мұндай зерттеулерді белгілі-бір мерзімнен соң жасайды.

 

 

ТАРАУ 9        ПАРАЗИТ ПЕН ЕГЕНІҢ ҚАРЫМ-ҚАТЫНАСЫ

 

Инфекциялық үрдістің пайда болуы мен дамуының негізін паразит пен егенің өзара қарым-қатынасы құрайды. Ол қарым-қатынас микробтартың адам организмінде патологиялық үрдіс тудыру қабілетіне ие болуына себепкер болатын бірқатар сатылардан тұрады. Патогенділік - ауру тудыруға бағытталған генетикалық детерминацияланған қабілет. Әрбір патогенді микроорганизм вируленттіліктің әртүрлі факторларының түзілуі туралы генетикалық ақпаратты алып жүреді. Вирулеттіліктің негізгі факторларына экзо- және эндотоксиндерді, кейбір ферменттер мен микроб жасушаларының құрамаларын (мысалы, кірпікшелер, капсула және т.б.) жатқызуға болады. Вируленттілік факторларын айқындау микроорганзмдердің индикациясы мен идентификациясындағы маңызды элемент болып табылады.

 

Тақырып 9.1. ИНФЕКЦИЯ, МИКРОБТАРДЫҢ ПАТОГЕНДІЛІГІ МЕН

                          ВИРУЛЕНТТІЛІГІ.

 

▲   Әдістемелік нұсқаулар

       Вируленттілік факторларын айқындаудың бактериоскопиялық әдістері

 С т р е п т о к о к к т а р д а н   к а п с у л а н ы   а н ы қ т а у  (2.2-ші тақырыпты қара).

        М и к  о б а к т е р и я  л а р д ы ң   к о  р д – ф а к т о р ы н   а й қ ы н д а у.  Цитратты қанның негізінде құралған сұйық ортаға ендірілген бұйым шынысындағы микобактерияларды өсіргенде вирулентті штаммдар өрілген шырмауықтай өседі. Оны корд-фактор деп атайды. Айқындау үшін шыныны Циль-Нильсен әдісімен бояйды ( 14.3.2 суретті қара).

        Б а к  т е р и я л а р д  ы ң   а д г е з и  я с ы н   а н ы қ  т а у. Кейбір инфекцияларда  бактериялар үлкен мөлшерде жасушалардың  эпителиальді мембранасына жабысады. Бұл құбылысты зақымдалған мүшенің  кілегейлі қабықшасынан Романовский-Гимзе әдісімен бояла дайындалған жағындыны микросокппен көре отырып айқындауға болады. Мұндай жасушалар "кілттік" деген атқа ие болды.

        А  я қ  т а л м а ғ а н   ф а г а ц и т о з  д ы   а й қ ы н д  а у.  (15.2.1суретті қара). Микроскоппен көру кезінде кәсіби фагоциттердің ішінде (қойнауында) бұзылмай сақтала орналасқан микроорганизмдердің  үлкен мөлшері байқалады.

        Экзоферменттер  мен экзотоксиндерді – патогенділік  факторларын анықтау. Г и а л у р о н и д а з а  сірке қышқылын қосқанда қойыртпақ түзуін тоқтататын гиалурон қышқылын гидролиздейтін фермент. Бұл ферментті анықтау үшін субстрат (гиалурон қышқылы) құйылған түтікшеге бактерияның тәуліктік дақылын немесе сорпалық дақыл сүзіндісін қосады да 37°С термостатта 15 минут бойы инкубациялайды. Құрамында гиалуронидаза бар сынамаларда қойыртпақ түзілмейді.

       П л а з  м о к о а г у л а  з а   зерттелуші дақылды 0,4 мл цитратты қан плазмасына  себу кезінде анықталады. Себінділерді 37°С термостатта 2-5 сағат бойы  инкубациялайды. Ферменттің өндірілген жағдайында плазманың ұюы жүреді, ал бақылау ортасында ол сұйық күйінде қалады.

       Г е м о  л и з и н д і  анықтау  үшін зерттелетін дақылды қанды  агарлы Петри табақшасына "теңбіл" түрінде себеді. Себіндіні 37°С термостатта 1 тәулік бойы инкубациялайды.  Оң нәтиже "теңбіл" айналасында мөлдір гемолиз аймағының түзілуімен анықталады.

       Б а к т  е р  и  а  л  ь д ы    э к з о т о к с и  н н і ң    (О-гемолизин) г е м о л и т и к  а л ы қ    б е л  с е н д і л і г і  н і ң    т и т р  і н     а н ы қ т а у.  β-гемолитикалық стрептококктың сорпалық дақылы филтратынан бірмәртелік сериялық сұйылту қатарын дайындайды. Олардың әрқайсысына бірдей көлемде қоянның шайылған эритроцитінің 5 % қоспасын қосады. Себінділерді 37°С термостатта 1  сағат бойы инкубациялайды. Онымен қатарлай эритроциттердің бақылау қоспасын қоректік ортада сол құрамда инкубациялайды. Нәтижесінде қан қызыл, мөлдір күйінде қалса гемолиз болмаған, ал эритроциттердің тұнбаға түсуі жүрсе гемолиз болған деп есептеледі. Осында стрептококктың сорпалық дақылы сүзіндісінің әлі гемолиз байқалмаған ең жоғары сұйытылуын (титрін) анықтайды. Әрі қарай осы сұйылтпаны  антистрептолизинді реакция қою үшін О-стрептолизиннің жұмыс дозасын анықтау кезінде қолданады.

       Л е ц и  т и н а з а  лецитинді агарға себу барысында айқындалады. Бұл ферментті бөліп шығарушы колония айналасында перламутр жылтырағы бар лайсаңдану аймағы түзіледі.

Л е ц и т и н а з а л ы қ   с ы н а м а: Жарақат бөліндісінен газды гангрена қоздырғышы – Clostridium perfringens-тің  α-токсинін жылдам анықтау және серологиялық идентификациялау үшін оның лецитиназалық белсенділігін клостридиялардың әрбасқа түрлерінің токсиндеріне қарсы антисарысумен нейтрализациялау реакциясын жасайды (12.2.2 кестесін қара). Осы мақсатта зерттелуші материалды (жарақат бөліндісі) лецитин ерітіндісі бар түтікшеге орналастырады да антисарысу қосады. Жарақат бөліндісінде лецитиназаның болуы түтікшедегі сұйықтықтың лайсаңдануымен айқындалады. Токсиннің лецитиназалық белсенділігін сәйкес антисарысумен нейтрализациялағанда сұйықтық мөлдір күйінде қалады.

      Ц и т о т  о к с и н д е р.  Жасушаларға  цитопатиялық әсер етуші (ЦПӘ) кейбір  бактериялық токсиндерді анықтау үшін жасушалық дақылдар қолданылады. Бактерияларды сорпада өсіреді де, оларды қоректік ортадан жеке бөліп алады. Бөліп алынған бактерияларды сезімтал жасушалар дақылына ендіреді. Оң нәтиже болған жағдайда инкубациядан соң өзіндік ЦПӘ байқалады. Бактериялық токсиндер бір-бірінен ЦПӘ сипаты бойынша ерекшеленеді, яғни жасушаның пішіні мен өлшемінің өзеруі, цитоплазмада вакуольдардың пайда болуы, жасушалық моноқабаттың бүтіндігі бұзылуы және т.б. мүмкін.

         Бактериялардың вируленттілігі мен бактериялық токсиндердің белсенділігін экспериментальді жануарларда анықтау әдістері.

      Ж а н у а  р л а р д ы   э к  с п е р и м е н т  а л ь д ы    з  а  л а л д а у. Инфекциялық  үрдіс Зертханалықжануарларды (қояндар, теңіз шошқасы, ақ тышқандар, егеуқұйрықтар т.б.) залалдау арқылы жасанды түрде жүргізілуі мүмкін. Бұл микроорганизмдердің патогенділігі мен вируленттілігін анықтау, әртүрлі материалдардан қоздырғыштың таза дақылын алу (биосынама әдісі), экспериментальді инфекция жасау және басқа да мақсаттар үшін жасалады.

       Жануарларды залалдау  терісіне, тері астына, бұлшық етіне, қан тамырына,  құрсақ ішіне  пероральді, интраназальді, интратрахеальді, интрацеребральді әдістермен жасайды. Барлық іс-шаралар стерильді инструменттер  көмегімен жүзеге асырылады. Тәжірибе алдында жануарларды таңдайды, салмағын өлшейді және белгі салады. Тышқанды құйрығынан ұстап үстел үстіне қояды, денесін екі саусақпен жылдам үстелге жаншып, саусақтарды арқасымен жылжыта отырып, бас терісінен қысып ұстайды. Сонда жануар сол қолдың жұмырында созылған күйде орнығады. Белгілі-бір концентрациядағы микроорганизмдер қоспасын ине арқылы шприц ішіне жинақтайды. Шиприцті оң қолда қаламұш сияқты ұстайды. Тері астына залалдау кезінде инені тышқан арқасының немесе құйрық тұсының тері қатпарына шаншиды да, баяу түрде, оның ішіндегіні тері астына жібереді. Инені жылдам суырып ала, егу жасалған орынды спиртке шыланған мақтамен басады. Құрсақ ішілік залалдауда жануарды ішектері көк етке ығысатындай етіп төбеден төмен қарай ұстайды. Ішінің сол жақ төменгі үштен бір терісіне  инені қиғаштатып  шаншиды да, шприцті құрсақ қабырғасына перпендикуляр жағдайға айналдыра ұстайды, екпінді қозғалыспен құрсақты тесіп кіріп шпиц ішіндегіні ендіреді. 

 

Сурет 9.1.1. Дерматонекрозды сынама. а – теріс реакция; б – оң реакция

 

       Д е р м  а т о н е к р о з  д ы   с ы н а м а. Қоянға  зерттелетін дақылдың 0,2 мл сорпалық  қоспасын жіңішке инелі туберкулин  шприцімен теріасты енгізеді. Оң  нәтижелі жағдайда 2-3 тәуліктен соң  ендіру орнында некроз ошағы пайда болады (9.1.1 сурет).

      К е р а т  о к о н ъ ю к т и  в а л ь д ы    с  ы н а м а  (Шерень сынамасы). Бактерияның тәуліктік агарлы  дақылын диаметрі 5 мл стандартты  құрықпен теңіз шошқасы көзінің  төменгі қабағына ендіреді. 2-3 тәуліктен  соң қасаң қабықтың лайсаңдануы, іріңдеуі мен ойық жаралануы бойынша кератоконъюктивиттің айқындылығын бағалайды.

М и к р о б   т о к с и н д е р і н і ң   л е т а л ь д ы   д о з а с ы н   а н ы қ т а у. Жануарлардың 50 %-інің өлуіне алып келетін токсин мөлшерін анықтайды. Осы мақсатта  бірқатар онеселік токсин сұйылтпаларын дайындап жануарлардың жекеленген топтарына ендіреді. Белгілі-бір мерзімнен соң жануарлардың әрбір тобындағы өлгендерінің саны бойынша LD50 есебін жүргізеді.