Автор работы: Пользователь скрыл имя, 25 Января 2013 в 15:23, контрольная работа
Иммобилизация ферментов путем присоединения их к тем или иным способом к инертной полимерной матрице – это та область, научных исследований, которая в настоящее время вызывает большой интерес у биохимиков, химиков–органиков, физико–химиков, микробиологов, биоматематиков, биофизиков и инженеров–химиков.
Белковые части ферментов построены из 20 аминокислот, соединенных между собой пептидной связью. Количество аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков составляет от нескольких десятков до тысяч. Однако качественный состав белков оказывается весьма сходным. Почти половину всех аминокислотных остатков белка составляют аминокислоты с неполярными или слабополярными боковыми группами. В результате этого за счет гидрофобных взаимодействий полипептидные цепи сворачиваются в глобулярные структуры, ядро которых составляют неполярные фрагменты полипептидных цепей, а наружный слой составляют звенья с полярными и ионогенными группами, таких как –SH, -OH, -COOH, -N[2]
Реакционная способность тех или иных групп белка существенным образом зависит от условий: макро и микро. Группу макроусловий составляют такие, как природа растворителя, рН среды, температура — эти условия могут и должны быть строго контролируемыми. Микроусловия, микросреда функциональной группы определяются структурой фермента, ее трудно изменять в нативном белке, но важно учитывать при выборе метода и внешних условий модификации.
В заключение необходимо подчеркнуть, что в целом белковые структуры весьма лабильны и существует огромное количество факторов, в том числе химических, вызывающих денатурацию и инактивацию ферментов. Поэтому исключительную значимость при операциях с белками приобретает выбор реакции и условий ее проведения: желательно, чтобы эти условия были мягкими и неденатурирующими. Что же касается получения, трансформации и химической активации носителей и сшивающих агентов, то здесь практически нет ограничений в выборе условий реакции. Без особого преувеличения можно сказать, что любой твердый материал (природный или синтетический) может быть использован при необходимости в качестве носителя ковалентно иммобилизованных ферментов. [2]
Присоединить белок (Ф) к носителю (Н) или сшивающему агенту (С) посредством амидной связи можно многими путями и при участии различных функциональных групп. Наиболее часто применяется реакция ацилирования аминогрупп фермента. В качестве ацилирующих агентов широко используются ангидриды:
и хлорангидриды карбоновых кислот:
|
В качестве ацилирующих агентов
также могут выступать
Реакционная способность активированных производных карбоновых кислот падает по мере уменьшения кислотности уходящей группы (от хлорангидридов до эфиров).
В качестве удобных ацилирующих
агентов в пептидном синтезе используют
производные О-ацилизомочевины:
Реакция (4) отражает взаимодействие аминогрупп фермента с носителем или сшивающим агентом, содержащими карбоксильные группы активированные карбодиимидом, R—N=C=N—R. Иными словами, карбодиимид служит конденсирующим агентом и равным образом осуществляет реакцию образования амидной связи за счет активированных карбоксильных групп белка и аминогрупп носителя или сшивающего реагента. Низкомолекулярные карбодиимиды сами по себе могут рассматриваться как своеобразные сшивающие агенты. Дело в том, что обработка белков такими карбодиимидами может приводить к образованию межмолекулярных и внутримолекулярных амидных связей между карбоксильными и аминогруппами белковых молекул: при этом исходный карбодиимид превращается в соответствующее производное мочевины и не входит в состав возникшего белкового конъюгата. В пептидном синтезе главным образом находит применение дициклогексилкарбодиимид, при трансформации которого образуется дициклогексилмочевина — труднорастворимое в воде вещество и поэтому легко отделяемое от водорастворимых целевых продуктов.
Это обстоятельство создаёт
определенные неудобства при необходимости
иммобилизации ферментов на твердых
носителях. Указанный недостаток устраняется
при использовании растворимых карбодиимидов,
имеющих гидрофильные и (или) заряженные
группы в боковых радикалах R и R', например,
1-циклогексил-3-[2-морфолино-(
Другой пример конденсирующего агента, достаточно широко употребляемого для ковалентной иммобилизации ферментов путем образования амидной связи, также заимствован из пептидного синтеза — это изоксазолиевая соль, реактив Вудворда:
Условия проведения реакции (5) с реактивом Вудворда в общем близки к условиям проведения реакции (4) с карбодиимидами, разница лишь в том, что в случае реакции (5) применимы и слабощелочные среды. Реакция (5) протекает весьма энергично и в ряде случаев при использовании реактива Вудворда, особенно при его избытке, обнаруживается инактивация ферментов.
Изоцианаты, RNCO, способны эффективно взаимодействовать с различными функциональными группами белков с образованием производных мочевины, таких, как диалкилмочевины, уретаны и уреиды. Наиболее реакционноспособными группами белков по отношению к изоцианатам являются аминогруппы:
Аналогичным образом могут быть применены изотиоцианаты. При этом, соответственно, образуются производные тиомочевины. Одним из самых распространенных методов активации природных полисахаридных носителей (или синтетических полиолов) является бромциановый метод. При обработке бромцианом на таких носителях формируются исключительно реакционноспособные, цианатные и имидокарбонатные,C=NH, группы. При взаимодействии белка с таким образом активированным носителем образуются изомочевины (7) и уретаны (8):
Полиольные носители (в том числе полисахариды) активируют также алкилхлорформиатами, при этом получают циклические карбонаты, эффективно взаимодействующие с аминогруппами белков:
При обработке нитрилов, например полиакрилнитрила, хлорводо-родом и спиртами в безводной среде получают хлоргидраты имидоэфиров. Имидоэфиры могут быть также синтезированы при алкилировании диметилсульфатом амидной группы, например, в полиамидах. В свою очередь они легко реагируют с аминогруппами белков с образованием амидинов:
Первичные α- и ε-аминогруппы белков могут быть трансформированы во вторичные в реакциях алкилирования и арилирования, а также путем восстановления азометиновых связей (оснований Шиффа).
Хорошо известными алкилирующими и ацилирующими агентами служат галогенпроизводные алифатических и ароматических углеводородов, а также метилкетонов. Взаимодействие носителей и сшивающих агентов, содержащих активный атом галогена при атоме углерода, с ферментами протекает по схеме (12):
В общем число алкилирующих и ацилирующих агентов очень большое. Но особого упоминания заслуживает метод, использующий хлорпроизводные 1,3,5-триазина, в частности цианурхлорид, из-за его простоты и надежности. В цианурхлориде три атома хлора связаны с атомами углерода. В присутствии соединений с HS-, H2N- и НО-группами происходит быстрое расщепление одной из трех С—Cl-связей, затем (более медленно) подвергается расщеплению и вторая группа, а третья обычно в реакции арилирования участия не принимает (время иммобилизации около суток при 4°С). Цианурхлорид может быть с успехом применен для активации носителей, например полисахаридов, а также как бифункциональный сшивающий или вшиваемый агент.
Исключительно эффективными алкилирующими агентами являются такие производные олефинов, как имины, оксиды и тиооксиды (оксираны и тиираны):
где X=>NH,>O,>S
Реакцию (13) можно проводить в средах с различными значениями рН, причем от выбора рН существенно зависит направление реакции: по амино- или оксигруппам белка.
Реакции как алкилирования, так и арилирования можно провести путем присоединения фермента (посредством его тиольных, амино- и гидроксильных групп) по активированным двойным связям. Для этой цели используют гидроксилсодержащие носители, предварительно активированные дивинилсульфоном или бензохиноном. Процесс иммобилизации можно представить, соответственно, схемами (14) и (15):
Одним из наиболее распространенных методов специфической модификации аминогрупп белков является образование азометиновых связей, —CH=N—, в реакциях белков с альдегидами (16):
Продукты конденсации амино- и альдегидсодержащих соединений — основания Шиффа — образуются легко и быстро в щелочных средах и в этих условиях весьма стабильны. Особенно широкое распространение в методах иммобилизации получили диальдегиды, такие, как глутаровый альдегид, используемый в качестве сшивающего агента. При применении низкомолекулярных альдегидов, в том числе глутарового, необходимо учитывать возможность образования разнообразных побочных продуктов полимеризации и поликонденсации уже в исходных реагентах. Это ее свойство может использоваться для удаления с носителя ковалентно иммобилизованного фермента путем простого изменения рН среды.
Однако устойчивости конъюгатов с азометиновой связью к кислотам можно добиться путем восстановления этой группировки:
Взаимодействие альдегидных и аминогрупп можно осуществить и таким образом, чтобы сразу получить прочный конъюгат. Примером такого процесса служит метод Уги, который схематически может быть представлен реакцией (18):
По методу Уги ферменты можно кова-лентно иммобилизовать на носителях, содержащих альдегидные группы, в присутствии изоцианатов как по амино-, так и карбоксильным группам. [3]
Соли диазония [Ar—N=N]+C1 способны вступать в различные реакции сочетания, скорость которых и направление существенно зависят от рН среды и природы ароматического субстрата. В реакциях азосочетания могут, в принципе, участвовать аминные, гуанидиновые, тиольные, имидазольные и фенольные группы белков, причем в ряде случаев с одной функциональной группой могут реагировать две диазогруппы.
В слабощелочной среде основной группой-мишенью в белке является фенольный радикал тирозина (атаке ионом диазония в этих условиях может также подвергаться незащищенный незаряженный имидазол гистидина):
В результате реакции (19) быстро образуется прочный конъюгат белка с носителем, связанный через диазогруппу.[3]
Способность к созданию дисульфидных мостиков может быть использована для ковалент-ной иммобилизации ферментов путем формирования межмолекулярных дисульфидных связей по реакции (20):
Окисление сульфгидрильных групп до дисульфидных протекает спонтанно под действием растворенного кислорода воздуха. С целью увеличения содержания тиольных групп в исходном белке проводят восстановление дисульфидных связей.
Однако реокисление тиольных групп может приводить к образованию «неправильных» внутримолекулярных дисульфидных мостиков в белке и, таким образом, сопровождаться существенной потерей каталитической активности иммобилизованного фермента. Содержание сульфгидрильных групп в белке можно увеличить за счет введения эндогенных групп, т. е. тиоли-рованием. Для этого, избрав в качестве групп-мишеней аминогруппы белка, обрабатывают их подходящими ацилирующими или алкилирующими реагентами, содержащими защищенную сульфгидрильную группу. В общем случае удобным приемом ковалентной иммобилизации ферментов путем образования дисульфидных мостиков является использование реакций тиол-дисульфидного обмена :
где Ri, R2 и R3 могут представлять собой белок, носитель, сшивающий агент и (или) радикал низкомолекулярного тиола. Реакции тиол-дисульфидного обмена обычно происходят в сильнокислой среде, но могут катализироваться тиольными анионами в нейтральных и щелочных растворах. [3]
Графт-сополимеризация осуществляемая путем химической прививки одного полимера к другому. Эта цель достигается при рекомбинации макрорадикалбв, образующихся в исходной смеси полимеров при воздействии мощного источника γ-излучения. Нетрудно представить себе аналогичную ситуацию, когда в роли одного из компонентов смеси выступает биополимер, фермент. Однако жесткое облучение ферментов сопровождается, как правило, их необратимой инактивацией. Потери ферментативной активности могут быть существенно снижены при переходе к фотоинициируемым реакциям. Примером фотореактивных агентов являются алкил- и арилазиды, которые, в свою очередь, могут входить в состав носителей или сшивающих агентов. При фотохимическом распаде таких соединений образуются молекулы азота и короткоживущие (0,1 —10 мс) высокореакционноспособные радикалы — нитрены: