Иммобилизованные ферменты

ВВЕДЕНИЕ

 

Иммобилизация ферментов  путем присоединения их к тем  или иным способом к инертной полимерной матрице – это та область, научных исследований, которая в настоящее время вызывает большой интерес у биохимиков, химиков–органиков, физико–химиков, микробиологов, биоматематиков, биофизиков и инженеров–химиков.

За последние 20 лет изучение иммобилизованных ферментов проводилось  на основе двух главных предпосылок. Во–первых, очевидно, что имеются  широкие потенциальные возможности  для исследования иммобилизованных ферментов в качестве регенерируемых, устойчивых и специфических и  специфических промышленных катализаторов. В связи с этим большое число работ было посвящено иммобилизации ферментов, имеющих промышленное значение, и сопутствующим проблемам разработки реакторов и крупномасштабных процессов. Однако, несмотря на широкий размах и глубину проведенных исследований, успехи в этой области пока еще невелики.

Во–вторых, иммобилизованные ферменты изучались с той целью, чтобы выяснить влияние гетерогенного  окружения на катализируемую ферментом  реакцию. Исследование высокоочищенных  ферментов в разбавленных растворах, где кинетика реакции соответствует  уравнению Михаэлиса–Ментен, много дало для понимания их поведения в этих условиях. Однако, как это не печально для энзимологов, большинство внутриклеточных ферментов никогда не функционирует в условиях, отвечающих уравнению Михаэлиса–Ментен, и обычно находится не в разбавленном растворе, а в сложной неоднородной среде. Поэтому, чтобы лучше понять регуляцию ферментов in vivo, было предпринято много попыток изучить влияние на них иммобилизации и определенной гетерогенной среды, а затем соотнести полученные сведения с ситуацией in vivo. [1]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ  ФЕРМЕНТОВ

Существуют два основных метода иммобилизации ферментов:

          – физический;

–  химический.

Физическая иммобилизация  ферментов представляет собой включение  фермента в такую среду, в которой  для него допустимой является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент  не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:

– адсорбция на нерастворимых  носителях;

– включение в поры геля;

– пространственное отделение  фермента от основного объёма реакционной  системы с помощью полупроницаемой  перегородки–мембраны;

– включение фермента в  двухфазную среду, где фермент растворим  и может находится только в  одной из фаз.

Главным отличительным признаком  химических методов иммобилизации  является то, что путем химического  взаимодействия на структуру ферментов в его молекуле создаются новые ковалентные связи в частности между белком и носителем. [2]

 

 

1. Физические способы иммобилизации ферментов

 

1. Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нерастворимых носителях

 

Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из всех существующих сейчас способов иммобилизации ферментов. Данный способ иммобилизации ферментов представлен на рисунке 1.

 

 

Рисунок 1 – Адсорбция  на нерастворимых носителях

 

Прежде чем понять механизм адсорбционной иммобилизации необходимо ознакомиться с понятием носители для  данного метода.  Носители для  адсорбционной иммобилизации можно  разделить на два основных класса — неорганические и органические. В качестве неорганических носителей главным образом используются кремнезем, оксиды алюминия, титана и других металлов, различные природные алюмосиликаты (глины), пористое стекло, керамика, активированный уголь и другие. Среди органических носителей наибольшее распространение получили различные полисахариды и  полимерные ионообменные смолы, коллаген.

Обычно носители применяются  в виде порошков, мелких шариков и гранул. Иногда для снижения гидродинамического сопротивления носители изготавливают в форме монолитов, пронизанных большим числом узких параллельных каналов, разделенных тонкими стенками. Важнейшими характеристиками носителей являются удельная поверхность, размер пор, механическая прочность и химическая стойкость.

Существует несколько  методов адсорбционной иммобилизации:

1. Статический способ

 Носитель вносят в водный раствор фермента и полученную смесь оставляют на некоторое время без перемешивания. Иммобилизация достигается за счет самопроизвольной диффузии фермента к поверхности носителя с последующей адсорбцией. Недостатком метода является то, что для получения препарата с высоким содержанием адсорбированного фермента и равномерного заполнения поверхности носителя последний приходится выдерживать в контакте с раствором фермента в течение длительного времени (несколько суток).

2. Способ с перемешиванием

 Носитель суспенизируется в растворе фермента и полученная смесь непрерывно перемешивается с помощью магнитной или механической мешалки. Этот способ гораздо эффективнее статического и обеспечивает более равномерное заполнение поверхности  носителя  адсорбированным  ферментом.

3. Метод электроосаждения

В этом случае в раствор фермента погружают два электрода, на поверхность одного из которых помещают слой носителя. При включении электрического тока молекулы фермента благодаря имеющимся на их поверхности заряженным группам начинают перемещаться в растворе в направлении соответствующего электрода и осаждаются на поверхности носителя.

4)Метод носителя на  колонке

Существует две модификации этого метода. В одной из них чёрез колонку, заполненную носителем, с помощью насоса прокачивают в направлении сверху вниз раствор фермента в режиме непрерывной циркуляции. В другом варианте метода направление потока изменено на противоположное, т. е. раствор фермента подается в нижнюю часть колонки, причем скорость потока подбирается так, чтобы частицы носителя оставались во взвешенном состоянии, образуя «кипящий слой». Метод нанесения в колонке обладает тем преимуществом, что позволяет проводить нанесение фермента, промывку, а затем и сам ферментативный процесс в одной и той же колонке без дополнительных манипуляций с носителем.[2]

 

 

2. Иммобилизация ферментов путем включения в гели

 

Суть этого метода иммобилизации  состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель( см. рисунок 2).

Рисунок 2 – Включение  фермента в поры геля

 

Среднее расстояние между  соседними цепями в геле меньше размера  молекулы включенного фермента, поэтому  он не может покинуть полимерную матрицу  и выйти в окружающий раствор, т. е. находится в иммобилизованном состоянии. Дополнительный вклад в  удерживание фермента в сетке  геля могут вносить также ионные и водородные связи между молекулой  фермента и окружающими ее полимерными цепями.

Пространство между полимерными  цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится значительная часть общего объема геля.

Для иммобилизации ферментов  в геле существует два основных способа.

1 способ -  Фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой образуется полимерный гель с включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки.

2 способ – фермент  вносят в раствор уже готового  полимера, который затем каим  либо образом переврдят в гелеобразное  состояние. [2]

 

3. Иммобилизация ферментов с использованием полупроницаемых оболочек (мембран)

Общий принцип, лежащий в  основе этого способа иммобилизации, состоит в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой мембраной, которая легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но представляет собой непреодолимый барьер для крупных молекул фермента (см. рисунок 3).Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемой мембраны и ее природой.[2]

Рисунок 3 - Иммобилизация  ферментов с использованием полупроницаемых  оболочек   Рассмотрим несколько  способов  данного метода иммобилизации: Микрокапсулирование  Суть метода состоит в том, что водный раствор фермента включают внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (мембраной). В зависимости от условий получения размер микрокапсул изменяется от нескольких десятков до нескольких сотен микрометров, а толщина мембраны составляет сотые — десятые доли микрометра при диаметре пор порядка нескольких нанометров. Существует два основных способа получения микрокапсул. В первом из них водный раствор фермента сначала диспергируется при энергичном перемешивании в диэтиловом эфире, содержащем ПАВ, которое выступает в роли эмульгатора. К полученной эмульсии, не прекращая перемешивания, добавляют эфирный раствор полимера, обычно нитрата целлюлозы. При соприкосновении с поверхностью эмульсионных капель этот полимер, будучи нерастворимым в воде, образует тонкую оболочку-микрокапсулу. Готовые микрокапсулы отделяют центрифугированием или фильтрованием и промывают. При втором способе микрокапсулирования  образование мембраны на поверхности водных микрокапель достигается за счет реакции межфазной поликонденсации двух компонентов, один из которых растворен в водных каплях эмульсии, а другой — в объеме органической фазы. Наиболее распространенными являются полиамидные микрокапсулы, получаемые, например, путем поликонденсации 1,6-гексаметилендиамина (водная фаза) и хлорангидрида себациновой кислоты (органическая фаза). Этот способ применим только для тех ферментов, которые не инактивируются при высоких значениях рН, существующих в водных растворах диамина.  Кроме того, более высокой  стабильности можно добиться, если  перед микрокапсулированием фермент  предварительно иммобилизовать  путем адсорбции на носителе, включения в гель или другим  способом. В некоторых случаях для  иммобилизации применяются микрокапсулы, мембрана которых образована ковалентно сшитыми между собой молекулами инертного белка.

2. Двойное эмульгирование

При иммобилизации методом двойного эмульгирования сначала готовят эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе полимера. Готовую эмульсию вновь диспергируют, но в воде. В результате получается водная эмульсиая из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие включенные капли водного раствора фермента. Через некоторое время органический раствор затвердевает, образуя полимерные сферические частицы с иммобилизованным в них ферментом.

С. Мэй и Н. Ли предложили модификацию этого способа иммобилизации, в котором в качестве материала для образования мембраны вместо водонерастворимого отверждающегося полимера используются жидкие углеводороды с большой молекулярной массой. Этот метод получил название иммобилизации путем включения в жидкие мембраны.

3) Включение в волокна

От микрокапсулирования этот способ иммобилизации отличается главным образом формой получаемых препаратов: в первом случае образуются сферические микрокапсулы, а во втором — нити. Суть состоит в том, что эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе волокнообразующего полимера (производные целлюлозы, поливинилхлорид, поли-L-метилглутамат) продавливают через фильеры в жидкость (например, толуол), вызывающую коагуляцию полимера. Полученные волокна представляют собой пористые полимерные гели, содержащие гомогенную дисперсию небольших капель водного раствора фермента размером около 1 мкм. Ферментсодержащие волокна обладают высокой механической прочностью Для дополнительного повышения механической прочности волокна иногда заключают в тонкую полиамидную оболочку.

4. Включение в липосомы                                  

Существует несколько  способов получения липосом, содержащих включенный фермент. В одном из иих раствор липида (обычно лецитина) в органическом растворителе (например, в хлороформе) упаривается в вакууме, и липид остается на стенках колбы в виде тонкой пленки. Затем в колбу вносят водный раствор фермента, встряхивают до полного удаления пленки липида со стенок колбы и оставляют на некоторое время. В полученной таким образом дисперсии липида происходит самопроизвольное образование (самосборка) мультиламеллярных липосом, содержащих включенный фермент. Во избежание окисления липида все операции необходимо проводить в атмосфере инертного газа.

В другом варианте метода раствор  липида в органическом растворителе наслаивают на поверхность водного  раствора фермента, после чего органический растворитель удаляют путем испарения в токе инертного газа, а образовавшуюся липидную пленку диспергируют в водном растворе. Недостаток этого способа состоит в том, что контакт с органическим растворителем может вызвать инактивацию фермента.