Иммобилизованные ферменты

Для удаления невключившегося  фермента липосомы отделяют центрифугированием и ресуспендируют в водном буферном растворе. В случае моноламеллярных  липосом, получаемых путем ультразвуковой обработки, разделение проводят методом  гель-фильтрации на колонке.

Недавно был предложен  новый способ иммобилизации ферментов путем включения их в полимерные липосомы. Для получения липосом в этом случае используются липиды, модифицированные путем введения в их молекулу кратной связи. После включения фермента в липосомы, приготовленные из модифицированного липида обычным способом, их подвергают облучению ультрафиолетовым светом в присутствии инициатора. При этом происходит полимеризация мономерных молекул липида с образованием ковалентоно сшитой замкнутой липидной бислойной мембраны.

 

 

1.1.4 Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного типа

 

Отличительная черта этого  способа иммобилизации состоит  в том, что ограничение свободы  перемещения фермента в объеме системы  достигается не за счет его взаимодействия с жестким носителем (адсорбентом, гелем или мембраной), а вследствие его способности растворяться только в одной из фаз двухфазной системы. Что касается субстрата и продукта ферментативной реакции, то они распределены между обеими фазами в соответствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного цикла процесса. Одним из важнейших преимуществ систем двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных субстратов, которые невозможны при применении жестких носителей с ограниченным размером пор ( см. рисунок 4).[2]

 

Рисунок 4 - Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного типа

Рассмотрим основные виды иммобилизации ферментов с использованием систем двухфазного типа:

1. Двухфазные системы типа«вода — несмешивающийся с водой органический растворитель»

В таких системах фермент  присутствует только в водной фазе, поскольку белки, как правило, нерастворимы в неполярных органических растворителях, выступающих в роли второй фазы. Объем водной фазы составляет обычно 1—2% от общего объема системы. В ходе процесса реакционную смесь осторожно перемешивают, чтобы ускорить диффузию субстрата и продукта через границу раздела фаз.

Основные недостатки этого  способа иммобилизации — низкая скорость процесса вследствие небольшой  площади поверхности раздела фаз и возможность инактивации фермента при его адсорбции на границе раздела фаз. Чтобы преодолеть это затруднение и добиться увеличения поверхности раздела, в качестве фермент содержащей фазы часто применяется крупнопористый неорганический носитель (например, пористое стекло), частицы которого  пропитаны   водным  раствором фермента.

2. Микроэмульсии

Проблема увеличения поверхности  раздела фаз может быть решена при использовании в качестве среды для ферментативных реакций микроэмульси типа «вода в масле». Методика получения ферментсодержащих микроэмульсий состоит в том, что фермент в виде водного раствора (в количестве нескольких объемных процентов от общего объема системы) или лиофилизованного порошка вносят в раствор ПАВ в неполярном органическом растворителе и энергично перемешивают в течение нескольких минут. В результате образуется полностью прозрачный гомогенный раствор, в котором молекулы фермента включены внутрь гидратированных обращенных мицелл ПАВ, или микроэмульсионных капель, причем в каждой белоксодержащей мицелле присутствует обычно только одна молекула фермента.

Ограничения, накладываемые  на скорость ферментативной реакции  диффузией субстрата и продукта, в микроэмульсиях практически отсутствуют  из-за огромной удельной поверхности  раздела между водными микрокаплями и органическим растворителем. Дополнительное преимущество таких систем состоит в том, что фермент, находящийся внутри микроэмульсионной капли, защищен от денатурирующего воздействия органического растворителя слоем молекул ПАВ. Микроэмульсии представляют собой универсальную микрогетерогенную среду для ферментативных реакций: практически все из нескольких десятков ферментов различных классов, изученных в микроэмульсионных системах, полностью сохраняют, а иногда и преобретают более высокую каталитическую активность по сравению с водным раствором.

3. Двухфазные водные системы

В основе этого способа  иммобилизации лежит тот факт, что водные растворы некоторых полимеров (полиэтиленгликоля, декстрана, поливинилового спирта и других) обладают свойством не смешиваться между собой или с концентрированным водным раствором электролита, образуя системы двухфазного типа. Обычно используемые концентрации полимеров в обеих фазах лежат в интервале от 5 до 15%. Наибольшее распространение получили системы, состоящие из несмешивающихся между собой водных растворов полиэтиленгликоля и декстрана, один из которых диспергирован в другом в виде мелких капель. Варьируя природу входящих в систему компонентов и объемное соотношение фаз, можно подобрать условия, при которых фермент и продукты реакции находятся преимущественно в разных фазах, что позволяет отделять продукты реакции от биокатализатора.

Наряду с рядом важных достоинств, к числу которых можно  отнести почти полное отсутствие диффузионных ограничений при протекании реакции, простоту приготовления и  доступность необходимых компонентов, двухфазные водные системы имеют  однако, серьезные недостатки. Главный  из них — это то, что вследствие эффектов распределения часть фермента, хотя и небольшая, всегда переносится в фазу, содержащую продукты реакции. Это приводит к загрязнению продуктов и потерям дорогостоящего катализатора. Чтобы избежать этого нежелательного явления, приходится применять дополнительные устройства, например мембранные ультрафильтры, что приводит к замедлению и удорожанию всего процесса.

 

2. Основные преимущества и недостатки физических методов иммобилизации

 

Для сравнения сводим основные преимущества и недостатки различных  способов физической иммобилизации  ферментов в таблицу 1. [3]

 

Таблица 1 - преимущества и недостатки физических методов иммобилизации

 

Название метода	Преимущества метода	Недостатки метода
Адсорбционная иммобилизация	- доступность и дешевизна  сорбентов;   - простота методики;   - многие из носителей  применяются для очистки ферментов	- недостаточно высокая  прочность связывания фермента  с носителем в результате чего  может произойти десорбция и  соответственно потеря дорогостоящего  биокатализатора и его загрязнение);   - отсутствие рекомендаций, позволяющих сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий проведения иммобилизации конкретного фермента
Путем включения в гели	- простота методики;   - можно получить ферментные  препараты любой геометрической  конфигурации;   - многократное использование  ферментных препаратов;   - это универсальный метод; - стабилизация фермента;   - надежная защита от  инактивации ферментов вследствие бактериального разложения	- полимерная матрица создает  препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую активность;   - если в роли субстрата  высокомолекулярное соединение, то  метод вообще не применим
С использованием полупроницаемых оболочек (мембран)	- простота и универсальность метода;   - получаются ферментативные  препараты с высоким содержанием  фермента;   - сохраняется каталитическая  активность фермента;   - стабильность возрастает	- невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов, для которых мембрана создает непреодолимый диффузионный барьер
С использованием систем двухфазного  типа	- позволяет  осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных  субстратов;   - в микроэмульсиях фермент  защищен от денатурирующего воздействия  слоем молекул ПАВ;   - в двухфазных водных  системах почти полностью отсутствуют  диффузионные ограничения, простота  приготовления и доступность  компонентов	- в системе “вода – органический растворитель” низкая скорость процесса, возможна инактивация фермента;   - в двухфазных водных  системах часть фермента переносится  в фазу с продуктами реакции,  что загрязняет продукт

 

 

 

2. ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

 

Главным отличительным признаком  химических методов иммобилизации является то, что путем химического воздействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи в частности между белком и носителем. [2]

Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюганта. Иными словами, при достаточно широком варьировании условий, таких, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких, как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Именно химическими методами, путем многоточечного ковалентного закрепления белковой структуры удается достигнуть наибольших эффектов стабилизации ферментов.

Речь идет о ковалентном  вшивании молекул фермента в различные типы сеток (ретикуляция фермента). Идея конструирования ферментных сеток вытекает из полифункциональной природы самой молекулы фермента, имеющей на поверхности помимо активного центра достаточно большое количество реакционноспособных групп.  При введении в раствор фермента бифункционального сшивающего агента отдельные молекулы фермента сшиваются друг с другом и образуют более или менее сложные агрегаты сетчатой структуры, в которой узлами служат сами молекулы фермента.

В зависимости от природы  и количества сшивающего реагента можно  получить как водорастворимые, так  и водонерастворимые препараты. [3]

Другой пример ретикуляции  основан на использовании ферментов, предварительно модифицированных реагентом, содержащим двойную связь. В этом случае при сополимеризации белкового макромономера с низкомолекулярными мономерами образуются сетчатые полимерные гели, сшитые белком или дополнительным сшивающим мономером. В рассматриваемой системе исходное состояние – жидкий раствор, конечное – твердое тело (гель). Сшивкой белка в объеме растворителя получают трехмерный гель в  виде крупного однородного блока, который можно механически измельчать(см. рисунок 5).

 

Рисунок 5 – Сополимеризация  в однородном растворе (трехмерная сетка)

 

Трехмерный гель в виде мелких частиц можно непосредственно  получать эмульсионной полимеризацией. Эмульсии получают диспергированием водного раствора, содержащего мономеры, в несмешивающемся с водой органическим растворителем. Предельный вариант таких систем – микроэмульсии, или гидратированное обращеие мицеллы ПАВ в органических растворителях(см. рисунок 6). Это новое качество иммобилизации – молекулярный уровень. [3]

 

 

 

Рисунок 6 – сетчатая оболочка вокруг молекулы фермента

Процесс ретикуляции может  быть реализован не только в растворе фермента, но и при использовании  его иммобилизованных препаратов. Так  в случае фермента, предварительно иммобилизованного на химическом инертном носителе путем физической адсорбции, дополнительная обработка сшивающим агентом приведет к повышению прочности(задубливанию) препарата. Носитель здесь непосредственно не принимает участия в химической реакции – он служит лишь матрицей для организации монослоя адсорбированного фермента и обуславливает двухмерную направленность ретикуляции. Более того носитель может быть вообще удален, и таким образом, получится сшитая ферментная пленка (см. рисунок 7).

 

Рисунок 7 – Межмолекулярная  двумерная сетка

Препараты молекулярно иммобилизованных ферментов могут быть получены, если обе группы бифункционального сшивающего агента провзаимодействуют с одной  молекулой белка. В таком случае речь идет о наложении «химических  скобок», внктри молекулярно закрепляющих структуру фермента (см. рисунок 8). Исключить межмолекулярные взаимодействия можно путем перехода от гомогенных к микрогетерогенным системам с пространственно изолированными молекулами фермента, например, солюбилизацией ферментов в органическом растворителе с помощью гидротированных обращенных мицелл ПАВ.

 

Рисунок 8 – Внутримолекулярная сетка из полипептидных цепей  белка и химических «скобок»

 

 

2.1 Химическая структура ферментов и их функциональные группы

 

Основой любого фермента является белок, представляющий собой компактную конструкцию из одной или нескольких полипептидных цепей, ковалентно связанных дисульфидными мостиками. Помимо белка ферменты иногда могут содержать и небелковые компоненты: простетические группы неорганической и органической природы, липиды (в липопротеидах) и углеводы (в гликопротеидах). В общем случае химические методы иммобилизации нацелены на модификацию функциональных групп в белковой части молекулы фермента. Однако при выборе процедуры иммобилизации для конкретного фермента целесообразно учитывать и специфические особенности строения его молекулы.