Технология получения ферментов из сырья животного происхождения

Получение:  Мочевую кислоту выделяют из гуано, где её содержится до 25 %. Метод синтеза заключается в конденсации мочевины с цианоуксусным эфиром и дальнейшей изомеризации продукта в урамил (аминобарбитуровую кислоту), дальнейшей конденсации урамила с изоцианатами, изотиоцианатами или цианатом калия.[4]

Конденсация мочевины с цианоуксусным эфиром с послед. изомеризацией образующейся цианоацетилмочевины в ура-мил, из к-рого по первому способу получают мочевую кислоту.

Мочевая кислота-исходное в-во для получения аллантоина, аллокса-на, парабановой к-ты, кофеина; компонент косметич. кремов;ингибитор коррозии; агент, способствующий равномерному прокрашиванию волокон и тканей.[4]

Заболевания:  Повышенное содержание мочевой кислоты в организме (крови) человека -- гиперурикемия.

Аллергии:  При гиперурикемии возможны точечные (похожи на укусы комара) проявления аллергии. Повышение содержания мочевой кислоты в организме можно избежать, уменьшив потребление кофейных напитков, особенно растворимого кофе, а также жвачки.

Подагра:  Отложения кристаллов урата натрия (соль мочевой кислоты) в суставах называется подагрой.

Применение: Мочевая кислота — исходный продукт для промышленного синтеза кофеина.[4]

 

4 ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ  ФЕРМЕНТОВ ИЗ СЫРЬЯ ЖИВОТНОГО  ПРОИСХОЖДЕНИЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА СЫРЬЯ  И МАТЕРИАЛОВ

 Для производства  пепсина пищевого говяжьего применяют  следующее сырье и материалы:

оболочки слизистые  сычугов крупного рогатого скота  по ГОСТ 16678-71 замороженные. а также в парном состоянии, собранные в соответствии с технологической инструкцией по заготовке эндокринно-ферментного и специального сырья, с соблюдением «Правил ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» для предприятий мясной промышленности. утвержденных в установленном порядке;

соль поваренную пищевую по ГОС Т 13830-97, выварочную, сорта экссра;

кислоту соляную по ГОСТ 3118-77.[5]

 

ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗГОТОВЛЯЕМОЙ  ПРОДУКЦИИ

 По органолсптическим, физико-химическим и микробиологическим показателям пепсин пищевой говяжий должен соответствовать требованиям ТУ 9219-560- 00419779-2000.[5]

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС

Технологический процесс должен осуществляться в  соответствии с технологической инструкцией, с соблюдением санитарных правил для предприятий мясной промышленности.[5]

ПОДГОТОВКА СЫРЬЯ И МАТЕРИАЛОВ

Проверяют качество поступившего сырья и взвешивают. Замороженную слизистую оболочку сычугов крупного рогатого скота размораживают на стеллажах при температуре не выше 30 °С в течение 24-?0 часов. Размороженное сырье измельчают на во-ттое с диаметром отверстий знспшей решетки (4,5 ±0,5) мм.

Поваренную соль просеивают через металлическое  сито с диаметром отверстии решетки (1,2 ±0,2) мм для освобождения от механических примесей.

• Первая экстракция

В чугунно-эмалированный  реактор с якорной мешалкой заливают воду с температурой (34+-2) °С и концентрированную соляную кислоту из расчета 2,5 дм (2,5 л) воды и 6 см соляной кислоты (уд. вес 1,19) на 1 кг сырья. При применении кислоты другого удельного веса производят пересчет. Измельченную слизистую оболочку загружают в реактор, производят перемешивание реакционной массы в течение 30 мин якорной мешалкой со скоростью 0,288-0,304 с (18-19 об/мин), контролируют, чтобы темпера р-ра в экстракте была (30+-1)°С. Величина рН 1,9-2,0 (в случае необходимости величину рН корректируют соляной кислотой). Общее время экстракции - 4 ч. По окончании экстракт жидкую часть смеси отделяют сифонированием с помощью резинового шланга, фильтруют на нутч-фильтре через один слой бельтинга, бязи и 4 слоя марли, перекачивают в запасной реактор и оставляют до получения второго экстракта.

• Вторая экстракция

К массе, оставшейся в чугунно-эмалированном  реакторе с якорной мешалкой после  сифонирования первого экстракта, добавляют воду и концентрированную соляную кислоту из расчета на 1 кг сырья 1,75 дм (1,75 л) воды и 3.5 см кислоты (уд.вес 1,19) до установления рН смеси 1.9-2,0 (если величина рН выше, ее дополнительно подкисляют). Установления рН смеси 1,9-2,0 (если величина рН выше, ее дополнительно подкисляют соляной кислотой). Экстракцию проводят при температуре (30+1) °С в течение 3 ч, из них 30 мин, считая с момента добавления соляной кислоты, смесь непрерывно перемешивают якорной мешалкой со скоростью 0,288-0,304 с¹ (18-19 об/мин), затем экстракт отстаивают. По окончании экстракции жидкую часть смеси отделяют сифонированием с помощью резинового шланга, фильтруют на нутч-фильтре через тот же набор тканей, остатки белковой массы утилизируют.[5]

ОБРАБОТКА ЭКСТРАКТА И КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТА

Отфильтрованные экстракты от первой и второй экстракции объединяют, охлаждают до температуры (18±1) °С, добавляют концентрированную соляную кислоту до установления рН 1,4-1,5 и выдерживают (22+2) ч при той же температуре. Затем делают пробное высаливание в стакане с внесением в экстракт различного количества поваренной соли (24±1) кг на 100 л фильтрата. После этого в реактор с экстрактом с помощью вакуума подают просеянную соль небольшими порциями до полного растворения, в соответствии с расчетом по пробному высаливанию и перемешивают якорной мешалкой со скоростью 0,288-0,304 ¹ (18-19 об/мин) не менее 30 мин. После растворения соли мешалку выключают и высоленной массе дают уплотниться в течение (13±1) ч при температуре (19±1) °С,

Примечание. В том случае, если бактериальная обсемененность препарата не превышает норму, допускается после охлаждения экстрактов до температуры (18±1)°С и пробного высаливания, добавлять поваренную соль по расчету без предварительного подкисления экстрактов до величины рН 1,4-1,5 и выдерживания их (22±2) ч при той же температуре.[5]

СЕПАРИРОВАНИЕ ВЫСОЛА

Отделение высола от маточного раствора осуществляют на сепараторе со скоростью 8,0 с¹ (5000 об/мин). В процессе сепарирования периодически проверяют прозрачность выходящего из сепаратора маточного раствора. По окончании процесса сепаратор останавливают, разбирают, высол снимают с барабана и направляют на сушку.[5]

СУШКА, ИЗМЕЛЬЧЕНИЕ, ПРОСЕИВАНИЕ  И СМЕШИВАНИЕ ФЕРМЕНТА С НАПОЛНИТЕЛЕМ

Высол фермента взвешивают, раскладывают тонким слоем на противни из нержавеющей стали и сушат в сублимационной сушилке таким образом, чтобы конечная температура сушки была (37,5+2,5) °С

Высушенный концентрат пепсина измельчают на шаровой мельнице до получения порошка тонкого помола. Соотношение массы сухого пепсина и массы шаров 1:2. Число оборотов мельницы 0,64 с¹ (40 об/мин). Время измельчения от 2 до 3 ч. Измельченный концентрат пепсина просеивают на вибросите через капроновое сито № 32.

Пробу просеянного  концентрата пепсина направляют на анализ для определения активности и микробиологической обсемененности После получения результатов анализа просеянный концентрат пепсина смешивают с поваренной солью до получения препарата стандартной активности.

Смешивание концентрата  пепсина пищевого говяжьего осуществляют путем проведения однотипных последовательных операции добавления расчетной массы поваренной соли к определенной массе концентрата пепсина и последующего лабораторного контроля продукта на молокосвертывающую активность.

Для практического  проведения процесса нормализации концентрата  пепсина пользуются формулой разбавления:

Мс = (А_к/А_п- 1)-М_к,

где Мс- масса добавляемой соли, кг;

М_к - масса концентрата говяжьего пепсина, подлежащая нормализации, кг;

А_к - активность концентрата говяжьего пепсина, усл.ед;

А_п - заданная активность нормализованного говяжьего пепсина, в усл.ед.

(100000-110000 усл.ед.).

Повышение концентрации пепсина в  производственных партиях (укрепление).

Если в процессе нормализации получена партия пепсина  с пониженной моло- косвертывающей активностью, увеличивают концентрацию пепсина путем добавления расчетной массы концентрата той же партии пепсина.

Для расчета необходимой массы  концентрата пользуются формулой:

М_к = [(Ат - А_п) Мп/( Ак - А_т)],

где М_к- масса концентрата пепсина, кг;

М_п - масса нормализуемого пепсина, кг:

А_т- требуемая активность пепсина усл.ед. (от 100000 до 110000 усл.ед.);

А_п- фактическая активность пепсина, подлежащего укреплению, усл.ед;

А_к - молокосвертывающая активность концентрата пепсина, усл.ед.

Каждую  партию препарата до расфасовки проверяют  в отделе технического контроля предприятия на соответствие требованиям настоящих технических условий. Объединенную пробу препарата, взятую из общего объема партии, исследуют сначала на активность, и только при получении удовлетворительных результатов по этому показателю определяют все остальные показатели.[5]

ВОПРОСЫ И ЗАДАЧИ

1. Приблизительно  рассчитайте число клеток печени  и митохондрий на кончике булавки  диаметром 0,5мм, зная размер клетки  печени 20000 нм, митохондрии 1500 нм. Предполагается, что все структуры имеют сферическую форму. [6]

Дано:

 

 

 

Решение:

;  ;

 ;

 ;

 ;

;

Ответ: клеток печени 625 штук, количество митохондрий 105484 штуки.

2. Раскройте  смысл и опишите механизм различных  методов консервации продуцентов.

Мутантные клетки легко реверсируют, т.е. подвергаются обратному мутированию. Поэтому новые свойства высокопродуктивного штамма необходимо закрепить и сохранить. Для этого используют гены – модификаторы, которые постепенно адаптируют новые свойства к общему метаболизму клетки. Кроме того, замедление реверсии обнаружено у двойных мутантов.

 Сохранить ценные признаки мутантов удаётся значительно легче, если они имеют какие – либо селективные преимущества: устойчивость к антиметаболитам – аналогам, снижение активности некоторых ферментов и т.д. Однако, как правило, сохранить преимущества мутантов удаётся с большим трудом и их приходится регулярно клонировать, отбирая активные клоны. Однако, при многократных пересевах частота реверсии резко возрастает.[7]

Для формирования банка промышленных мутантов и возможности использования  их по мере необходимости следует  обеспечить приемлемую консервацию  продуцентов. Для этого используют несколько приёмов:

- понижение  температуры. Активную форму промышленных  микроорганизмов в течение 1-2 месяцев удаётся поддерживать  при температуре 4-С. Нередко микроорганизмы хранят в замороженном состоянии, но даже при температуре от -15° до -30°С наблюдается массовая гибель биообъектов. Выживаемость микроорганизмов оказывается максимальной при температуре -130°С. При этой температуре через 3-5 лет выживаемость микроорганизмов составляет 40-70%, а через 10-20 лет- 20%.

- хранение  культур под слоем минерального  масла. Обычно применяют хорошо  простерилизованное вазелиновое  масло высокой вязкости (плотность 0,8-0,9). Например, продуцент пиницеллина сохраняет активность и жизнеспособность даже после 3-5 летнего хранения под слоем масла.

- консервация микроорганизмов оказывается успешной при сохранении их в почве, торфе, кварцевом песке и т.д. Жизнеспособность, например, микромицетов в песке составляет 10-15 лет.

- для  консервации, в частности спор  микромицетов, используют активный уголь, высушенные питательные субстраты; продуценты пенициллина хорошо сохраняются на пшене и т.д.

- используется  также высушивание спор в вакууме  или высушивание живых клеток (например дрожжей) в конвеционной сушилке;

- в  последнее время широко применяется  лиофилизация. При этом методе  вода при пониженном атмосферном  давлении испаряется из замороженного  высушенного образца, превращаясь  в пар, минуя жидкое состояние.  Для лиофилизации микробных культур  обычно используется температура  от -45°до -60°С, время экспозиции 1-2 часа, а атмосферное давление – 200-500 мм рт. ст. Благодаря лиофилизации большинство спор грибов и вегетативные клетки бактерий сохраняют жизнеспособность в течение 15-20 лет.

Обычно, после длительного хранения позитивные свойства микроорганизмов несколько снижаются, но после ряда пересевов восстанавливаются в полном объёме. Применяют также антимутагены, которые препятствуют реверсии, используют двойные мутанты или создают условия, которые обеспечивают продуценту различные преимущества и др.[7]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ ЛИТЕРАТУРЫ

1. - Шлегель Г. - Общая микробиология, М., 1987, 567 ст.

2. - Р.Г. Бутенко  Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологий на их  основе. М., 1999 153 ст.

3. -  электронная  энциклопедия википедия http://ru.wikipedia.org

4. -  Иванский  В. И., Химия гетероциклических  соединений, М., 1978, с. 432-34

5. -  ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ  ИНСТРУКЦИЯ ПО ПЕПСИНУ 24 ст.

6. -  А. Ленинджер  Основы биохимии 1 том М., 1985, 369 ст.

7. – В.А. Блинов Общая биотехнология, часть 1, С., 2003, 163 ст.