Технология получения ферментов из сырья животного происхождения

Маслянокислое брожение – анаэробное окисление органических веществ маслянокислыми бактериями в масляную кислоту.

Химизм процесса:

С₆H₁₂О₆ → СНзСН₂СН₂СООН + 2 С0₂ + 2Н₂ +Е

                          глюкоза         масляная  кислота

Возбудители маслянокислого брожения

Маслянокислые бактерии относятся к роду Clostridium. Это крупные, подвижные грамположительные палочки, образующие устойчивые споры, при образовании которых клетка приобретает форму веретена или теннисной ракетки, облигатные (строгие) анаэробы.

Маслянокислые бактерии широко распространены в природе. Обитают там, где много органических веществ и нет доступа воздуха – в иловых отложениях водоемов, навозе, почве и т.д.

Эти бактерии могут сбраживать многие углеводы, в т.ч. (крахмал, гликоген, пектиновые вещества, целлюлозу), спирты (этиловый, маннит, глицерин) и аминокислоты. По характеру используемых субстратов маслянокислые бактерии делятся на две группы: сахаролитические клостридии, которые сбраживают в основном углеводы (Ctostridium butyricum), и протеопитические клостридии, которые разлагают белки и пептоны до аминокислот и затем их сбраживают (Clostridium sporogenes, Clostridium subterminalis, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum).[1]

 

Практическое значение маслянокислого брожения. Маслянокислое брожение используется в промышленности для получения масляной кислоты (продуцент Clostridium butyricum). Хотя масляная кислота обладает резким, неприятным запахом прогорклого масла, ее эфиры отличаются приятным ароматом: метиловый эфир имеет яблочный запах, этиловый – грушевый, амиловый – ананасный. Эфиры масляной кислоты используют в кондитерской, безалкогольной, парфюмерной промышленности.  

Маслянокислые бактерии участвуют в круговороте веществ в природе. С другой стороны, маслянокислые бактерии могут вызвать массовую гибель картофеля и овощей, вспучивание сыров, порчу консервов, прогоркание масла и маргарина, увлажненной муки и других продуктов, чем наносят большой урон народному хозяйству. Борьба с маслянокислыми бактериями затруднена из-за высокой устойчивости спор.[1]

Уксуснокислое брожение – аэробное окисление углеводов и спирта уксуснокислыми бактериями в уксусную кислоту. Таким образом, это брожение относится к неполным окислениям или окислительным брожениям. Суммарное уравнение процесса имеет вид:

 

С₆H₁₂O₆ + 2 0₂ → 2СНзСООН + 2CO₂ + 2Н₂0 + Е     или

глюкоза               уксусная кислота

 

СНзСН₂ОН + O₂ →   СНзСООН + Н₂О + Е

этиловый спирт         уксусная кислота

Возбудителями уксуснокислого брожения являются уксуснокислые бактерии, относящиеся к двум родам: Gluconobacter и Acetobacter. Это короткие, подвижные грамотрицательные палочки, не образующие спор. Оптимальная температура развития – 30˚ С. Бактерии кислотоустойчивы, оптимальное значение рН для развития 5,4–6,3. Обитают на цветах, зрелых фруктах, ягодах, овощах, в прокисших соках, пиве, вине, квашенных овощах.

Практическое  значение уксуснокислого брожения

Используется в промышленности для получения натурального спиртового уксуса (продуцент Acetobacter aceti). Кроме того, производят также винный уксус (из вина) и яблочный уксус (из яблочного сока). С другой стороны, уксуснокислые бактерии являются вредителями спиртового,   пивоваренного,   консервного   производств,   виноделия, производства безалкогольных напитков.[1]

2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТКАНЕЙ И КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Как правило, большинство исследований проводятся с эксплантами разных органов, тканей и клеток семенных растений (голо- и по-крытосеменных). Низшие растения (многоклеточные водоросли) и споровые высшие растения (мхи, хвощи, папоротники) привлекаются в культуру реже. Это можно объяснить большой ролью в жизни человечества покрыто- и голосеменных растений начиная с древесных форм, луговых трав и культивируемых в сельском хозяйстве растений, которые кормят человечество. Многоклеточные водоросли трудны для поддержания их в культуре, хотя они, несомненно, перспективны в качестве источников Биопродуктов для медицины, пищевой промышленности и других биотехнологий. В литературе в качестве объектов, используемых для культивирования in vitro, можно встретить мхи, лишайники, папоротники. В этих случаях культуры клеток используют для изучения специфических указанных растений процессов.[2]

Большое внимание биологи отводят  выращиванию микроводорослей. Их культивирование в ферментерах при условии обеспечения светом процесса фотосинтеза, с одной стороны, позволяет решать фундаментальные проблемы фотосинтеза и связи его с клеточным циклом и судьбой популяции (Л. Цоглин и Н. Гавель, 1994), а с другой стороны, в ферментерах микроводоросли выращиваются с целью использования их биомассы и фитопродуктов в качестве сырья для промышленности.

Вернемся к эксплантам, полученным от разных таксонов высших растений. Они очень различны, однако в настоящее время нет такого высшего растения, от которого нельзя получить культивируемые ткани и хлетки. Растущие поверхностно на агаре, агарозе, гельрите каллусные ткани и растущие в жидкой питательной среде суспензионные клеточные культуры требуют создания разных условий для разных таксонов.

Наиболее легкими объектами  для культивирования являются двудольные травянистые растения, затем следуют  однодольные травянистые виды и  зерновые культуры. Труднее создать  условия для стабильных in vitro культур древесных растений, особенно голосеменных. Древесные растения по мере старения теряют способность к образованию каллуса. Особенно это свойственно хвойным породам в возрасте более 12—15 лет. Для работы с наиболее интересными для практики «сильными» деревьями (а это становится явным в более зрелом их возрасте) применяется метод омоложения. Для этого используется обработка черенков смесью регуляторов роста (цитокинины, ауксины, витамины, стимуляторы роста). В работах Е. Калашниковой (1992) и К. Хмары (1990) манипуляции с черенками хвойных таксонов ели и сосны позволили получить размножение этих древесных пород как путем черенкования побегов, так и путем морфогенеза из каллусных тканей. Подробно используемый ими метод будет описан в главе «Биотехнология клонального микроразмножения».[2]

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (АСЕПТИКА)

Первичный эксплант должен быть полностью освобожден от всех микроорганизмов (бактерий, грибов, микоплазм и т.д.), и его дальнейшее существование in vitro требует поддержания абсолютной асептики, так как грибная и бактериальная инфекция ингибирует рост клеток и приводит культуру к гибели.

Перед стерилизацией экспланта фрагмент растения тщательно промывается водой с мылом, затем следует процедура поверхностной стерилизации эксплантов в растворах дезинфицирующих средств (сулема, диацид, гипохлориты кальция, натрия, калия). В стерилизующий раствор хорошо добавить эмульгатор, например Твин-20 (одна капля на 100 мл раствора).[2]

В табл. 1 представлены условия стерилизации эксплантов разных объектов (концентрация и время инкубации).

После инкубации эксплантов в стерилизующем растворе их промывают тремя порциями стерильной воды по 10 минут в каждой. Затем полезно острым дезинфицированным ланцетом удалить наружный слой клеток на срезах экспланта, так как наружный слой клеток мог быть поврежден при дезинфицировании.

Таблица 1

Стерилизация  исходного растительного материала

Объект	Время стерилизации, мин
	диацид 0,1%	сулема 0,1%	гипохлориты Na, Са 5-9%	перекись водорода 10-12%	Антибиотики
семена сухие	15-20	10-15	15-20	12-15
семена набухшие	6-10	6-8	10-15	6-8
кусочек мясистого корня, стебля	20-30	15-25	15-20	_
покров стебля	20-40	20-25	20-25	—	Ткани
листья	1-3	0,5-3	3-6	3-5	стебля
цветы	1-10	0,5-7	3-15	2-7	чая

 

Иногда кроме поверхностной  стерилизации приходится прибегать  к антибиотикам, убивающим микробиальную флору внутри ткани. Выбрать слезно действующий антибиотик трудно, и не всегда оздоровление экспланта при этом удается. В качестве одной из удач можно привести пример освобождения от внутренных микробов эксплантов чая (Ниссанка Мюри 1990)

В литературе отмечены случаи, когда  образование каллуса и рост кажутся  вполне благополучными, однако после  ряда субкультивировании рост клеточной массы начинает снижаться. При этом явного  присутствия микробиальной флоры незаметно, однако состояние культур существенно ухудшается. Можно полагать, что в этом случае споры бактерий в течение длительного срока задерживались в развитии выделениями растительных клеток.[2]

В лаборатории автора наблюдали  такой процесс для одного из клонов диоскореи дельтовидной — продуцента стероидных гликозидов (анпитрессового фитопродукта этой культуры). В течение длительного времени рост культуры диоскореи был нормальным, но после ряда пересадок рост клеток снижался, среда становилась мутной, в ней обнаруживались бактериальные клетки, и культура постепенно погибала. Можно предположить, что споры некоторое время ингибировались стероидными  гликозидами диоскореи дельтовидной. Вряд ли описанный феномен просто результат занесения бактерий, тогда бы гибель культуры произошла быстро, а не была бы растянута на длительный срок. Вопрос о существовании клеток растений и бактериальных спор и бактериальных эндосимбионтов в культуре in vitro еще требует изучения.

Стерильные условия выращивания  обязательны для манипуляций  с бъектами in vitro. Обычно работы с культурами проводятся в ламинарбоксах, где асептика достигается подачей фильтрованного стерильного воздуха в рабочий объем. В ночное время, чтобы увеличить надежность сохранения асептики, рекомендуется включать УФ-лампы. В последнее время при работе с клетками животных и растений вместо ламинарбоксов предпочитают работу в асептических комнатах. Экспериментатор, работающий в такой комнате, обязан иметь специальную одежду и быть подготовленным к асептической работе.

Посуда, инструменты, бумага стерилизуются, как правило, в сухожарных шкафах при температуре 160 °С либо в автоклаве при избыточном давлении 0,15 мм ртутного столба в течение 60 минут.

Компоненты питательных сред, которые  не разрушаются при темпе-ратуре около 120 °C, можно стерилизовать в автоклаве. Фильтрованием через ультрафильтры можно стерилизовать все компоненты сред (кроме агарозных основ) или только те компоненты, которые заведомо не выно-сят нагрева до 120 °С. Фильтрование производят в стерильных условиях (в ламинарбоксах). Агар и агарозу обычно добавляют в питательные среды в твердом виде перед автоклавированием.[2]

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И  ФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ,

ОПТИМАЛЬНЫЕ ДЛЯ КУЛЬТУР

Генетически и эпигенетически различные экспланты и каллусные ткани даже в пределах вида часто требуют разных химических и физических условий выращивания in vitro. Начнем с главного — с питательных сред.

В 1932 г. французским ученым Роже Готре были созданы питательные среды, которые позволили ему получить первичные каллусы на срезах ветвей древесных растений и каллусов паренхимы корнеплодов. В то же самое время американский ученый Р. Уайт (1934) модифицировал среду Успенских и применил ее для пересадочной культуры корней растений.

Наиболее часто используемой питательной  средой по праву можно назвать  среду Мурасиге (правильнее — Мурашиге) и Скуга — среда MS. Она была предложена Тошио Мурашиге и Фольке Скугом в 1962 г. Эта среда, как правило, подвергается разным модификациям, что реже относится к макро- и микроэлементам минеральной среды и чаще касается наборов витаминов, гормональных и других регуляторных факторов.

Основная минеральная среда MS была подобрана авторами для кал- лусной ткани табака сорта <Висконсин>, возникшей на экспланте — паренхиме стебля в средней его части. Именно при этих условиях Ф. Скуг и С. Миллер в 1954—1957 гг. манипулировали соотношением кинетина и ауксина в среде, направляя культуру на разные пути развития. При примерно равных количествах кинетина и ауксина в среде происходило образование быстро растущего каллуса. При увеличении дозы ауксина возникали корни, при преобладании кинетина — стеблевые культуры.

В табл. 2 представлены наиболее различающиеся  между собой среды, предложенные разными авторами, и указано, для  каких видов растений они более  приемлемы.[2]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 2

Состав разных питательных сред, применяемых при культивировании in vitro

 

 

1 литр  среды Као и Михайлюка содержит дополнительно: рибозы, ксилозы, ман- нозы, рамнозы, целлобиозы, сорбита — по 125 мг, маннита, никодинамида, аскорбиновой кислоты — по 1 мг; витамина А — 10 мг; витамина Ds — 0,5 мг; Са-пантотената — 0,01 мг, витамина В12 — 0,2 мг; n-аминобензойной кислоты — 0,01 мг; биотина — 0,005 мг; хо- линхлорида — 0,5 мг; рибофлавина — 0,1 мг; 2,4-Д — 0,2 мг; зеатина — 0,5 мг; НУК — 1 мг; гидролизата казеина — 125 мг, кокосового молока — 10 мл; СаСЬ, 30% — 1,5 мл; глюкозы — 68 400 мг; пирувата Na — 5 мг; лимонной кислоты — 10 мг; яблочной кислоты — 10 мг; фумаровой* кислоты — 10 мг.

 

Продолжение табл. 2

Способ  приготовления концентрированной (1 X 10) минеральной основы

среды по прописи Мурасиге и Скуга

А	Б	В	Г	д	Е
MgS04 х 7Н20 MnS04 х Н20 ZnS04 х 7Н20	KNO, nh4no3	СаС12 х 2Н20 кн3ро4 н,во4 KJ	CuS04 х 5Н20	Na2Mo04 х 2НгО	СоС12 х 6Н20

 

Ингредиенты частей А, Б, В растворить в 100 мл бидистиллированной воды, смешать А + Б, добавить В, добавить по 1 мл растворов CuS0₄, Na₂Mo0₄ и СоС1₂. Развести в 10 раз при приготовлении среды.

ПРИЛОЖЕНИЕ  К ТАБЛИЦЕ 2

1. Среда Мурасиге и Скуга — наиболее универсальная и многоцелевая среда, пригодная для растительных клеток многих видов.

Среда MS (Мурасиге и Скуга) дает хорошие результаты при каллусообразовании у большинства растений, хорошо поддерживает неорганизованный каллусный рост и вызывает индукцию морфогенеза у большинства двудольных видов.