Технология получения ферментов из сырья животного происхождения

2. Среда Гамборга и Эвелега (Среда В-5) дает хорошие результаты при культивировании клеток и тканей бобовых растений и злаков.
3. Среда Уайта — для укоренения побегов и нормального роста стеблевой части после регенерации.
4. Среда Ничей, китайские среды — рекомендуются для индукции андрогенеза в культуре пыльников. Последние также используются для индукции морфогенеза у злаков.
5. Среда Као и Михайлюка — для культивирования единичных (или с малой плотностью высева) изолированных протопластов и клеток.

Физические  параметры: рН 4,0—5,0, температура 26 + 1°, свет белый, 16 часов.

 

Следует отметить, что при использовании  среды MS в качестве минеральной основы многие объекты, прежде всего злаки, обычно плохо реагируют на большую  дозу азота, особенно в случае преобладания азота в аммиачной форме.

По этой же таблице можно оценить  различия в содержании витаминов  и угдеводов сред (обязательного источника питания гетеротрофных культур) и, наконец, рН среды. Последний фактор достаточно важен, так как однодольные растения, особенно злаки, в культуре растут при повышенном рН (примерно 6,0), тогда как обычно рН среды после автоклавирования остается на уровне 4,5—5,0.

На рис. 2 приведены формулы регуляторов  роста гормонального типа; в табл. 3 собраны данные о регуляторах  — экстрактах растительного происхождения. Как правило, это эндоспермы незрелых зародышей и весенняя пасока некоторых деревьев. Добавление их в среду почти всегда эффективно, но при этом эксперименты трудно воспроизводятся, так как действующий компонент, как правило, точно неизвестен. В табл. 4 — концентрации антиоксидантов, вносимых в питательные среды. [2]

Таблица 3

Экстракты и комплексные добавки  к питательным средам для культивирования  незрелых гибридных зародышей

Добавки                                                                                                                        Концентрация, %

1. Эндоспермы:

кокосовый орех 7—20

конский каштан 5—15

кукуруза  и другие злаки 10—15

Березовый сок 10—20

2. Экстракты из органов вегетирующего растения 0,1—1

4. Томатный сок 5—10

Солодовый экстракт 5—10 

5. Дрожжевой экстракт 0,1—0,2 7.
6. Гидролизат казеина 0,02—0,1

Таблица 4

Набор и концентрация антиоксидантов, вносимых в питательные среды

 

 

При выращивании каллусных культур поверхностным способом используют очищенный агар-агар типа «Дифко» или агарозу. В последнее время большим успехом пользуется гельрит.

Несомненно, что кроме питательной  среды и регуляторов при культивировании  большое значение имеет точное соблюдение физических факторов. Генетически и  эпигенетически разные культуры неодинаково относятся к температуре. Так, каллус и суспензия клеток женьшеня прекращают рост при температуре 27 °С, а каллусы и суспензия клеток диоско-

реи дельтовидной еще хорошо растут при температуре 32 °С. Как правило, экспериментаторы выбирают температуру, которая могла быть приемлемой для разных генотипов. Температура в камерах фитотрона в большинстве лабораторий поддерживается на уровне 26 ±1 °С.

Каллусные культуры и клеточные суспензии выращиваются либо в темноте, либо под лампами белого света. Свет разного качества, несомненно, влияет на процессы первичного и вторичного метаболизма, и этот материал будет представлен в следующих главах. То же относится и к эффекту состава газов при поверхностном и суспензионном выращивании клеточных популяций. Такие воздействия, как фотопериод, действие постоянного электрического тока, также будут рассмотрены в следующих главах.

Однако все перечисленные в  этой главе факторы и условия  оптимизации выращивания могут быть собраны в одном эксперименте, и их действие может быть проанализировано с помощью математического планирования биологического эксперимента (В. Максимов, 1980). [2]

Методики культивирования одиночных  растительных клеток

Отдельные клетки культивируют для  получения клонов, изучения их генетической и физиологической изменчивости или стабильности. Кроме того, культивирование  отдельных клеток позволяет изучать  условия, определяющие возникновение  стимулов к делению у клеток, изолированных  от влияния других клеток популяции  или ткани. Отдельные клетки также  важны для клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. Обычно в такие клетки вводят маркерные гены, которые позволяют  осуществлять селекцию.

Кроме того, отдельные клетки могут  служить моделью для сравнительного изучения физиологических процессов  в ткани и изолированной клетке. Например, для изучения фотодыхания можно сравнивать процесс фотосинтеза на уровне отдельных клеток мезофилла листа и целой ткани.

Выращивание изолированных клеток складывается из двух этапов: 1) изолирование неповрежденной клетки растительной или  каллусной ткани; 2) создание условий, благоприятных для роста и развития изолированной клетки.

На первом этапе необходимо выделить неповрежденную и жизнеспособную клетку из ткани целого растения или каллусной ткани. Этого можно достичь путем обработки ткани пектиназами, что ведет к мацерации ее клеток. Однако не всегда после такой обработки клетки сохраняют способность к последующим делениям и образованию ткани. Лучше получать отдельные клетки из суспензионных культур или рыхлого каллуса. Идеальными отдельными клетками являются протопласты, образовавшие клеточную стенку.

Далее клетки изолируют либо при  помощи микроманипуляторов, либо путем  ряда последовательных разведений. При  первых же попытках культивирования  отдельных клеток возникла важная научная  проблема: как заставить делиться клетки, изолированные от влияния  других клеток популяции или тканей? Отдельные клетки вели себя иначе, чем  их скопления в виде агрегатов  в суспензии или каллусной массы на поверхности питательной среды.

При ее решении возникла гипотеза о «факторе кондиционирования». Так  было названо вещество, стимулирующее  деление отдельных клеток. Определено, что этот фактор имеет химическую природу, термолабилен, водорастворим, низкомолекулярен (М.К. Павлова, Р.Г. Бутенко, 1965), видонеспецифичен, не заменяет известные фитогормоны, синергичен с брассиностероидами. Было предложено несколько вариантов культивирования отдельных клеток.

Впервые подобрать условия, подходящие для деления отдельных клеток, удалось в 1954 году Мьюиру, Хильденбранту и Райкеру. Этот способ получил название метода «ткани – няньки» (рис. 2).[2]

Рис - 2. Схема использования каллуса в качестве «ткани - няньки» 

Клетку изолируют при помощи микроманипулятора из рыхлого каллуса  непосредственно на кусочек фильтра  размером 8 * 8 мм, помещенный на верхушку каллусной ткани, из которой была взята клетка. Каллус должен находится в фазе активного роста. Можно также в качестве «няньки» использовать каллусную ткань другого растения родственного вида. В этом случае клетки растут и делятся. По мере старения каллуса – няньки фильтр с клетками переносится на молодой каллус. Когда ткань из клетки достигает размеров 0,5 – 1 мм, то ее можно высаживать непосредственно на питательную среду.

Проводились также эксперименты по высаживанию клетки непосредственно  на агаризованную среду, но обязательно рядом с фильтром, который в течение нескольких дней контактировал с молодой, интенсивно растущей каллусной тканью. Поскольку эти работы показали, что постоянный контакт клетки через фильтр с каллусной массой не является обязательным для деления клетки, то было предложено использовать старую культуральную среду для стимуляции одиночной клетки к делению. 

Можно также использовать метод  «кормящего слоя». Для этого берут  суспензию клеток того же вида, что  и одиночная клетка, или близкого вида. Клеточная суспензия должна находиться в ранней экспоненциальной фазе ростового цикла. В 1959 году Бергман  предложил фильтровать суспензионную  культуру (в его экспериментах  это были табак и фасоль) стерильно  через один слой батиста (ячейки 0,3 * 0,1 мм). В результате получали суспензию, на 90% состоящую из отдельных клеток. Эту суспензию смешивали с  агаризованной питательной средой того же состава, что использовался при культивировании суспензии (среда содержала 0,6% агара). Смесь разливали тонким слоем (1 мм) в чашки Петри. Агар разделял клетки, но не препятствовал обмену химическими сигналами между ними, а толщина слоя позволяла смотреть за их поведением под микроскопом.

Индукция делений отдельных  клеток возможна при применении очень  богатой питательной среды, например, среды Као и Михайлюка. При этом объем среды, в которую помещаются клетки, должен был минимальным (микрокапли объемом до 20 мкл).

Все эти способы культивирования  позволяют клетке «ощущать» фактор кондиционирования. Он либо вырабатывается в достаточном количестве клетками «кормящего слоя», «ткани – няньки», либо содержится в суспензии, где  ранее культивировались клетки, либо не теряется в большом объеме среды. Таким образом, фактор, вызывающий деление  клеток, вырабатывается самими клетками, но в небольшом количестве. И только увеличивая число клеток, вырабатывающих этот фактор, чтобы он не рассеивался  в больших объемах питательной  среды, или же уменьшая объем среды, в котором будет выращиваться клетка, можно заставить ее делиться.[2]

 

3.1 ГИПЕРУРИКЕМИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА

Гиперурикемия — повышенное содержание мочевой кислоты в крови. Максимальная величина для нормального уровня составляет 360 микромолей/литр (6 мг/дл) для женщин и 400 микромолей/литр (6,8 мг/дл) для мужчин.[3]

Причины

Гиперурикемия вызывается ускоренным образованием мочевой кислоты из-за участия пурина в обмене веществ, или из-за ослабленной работы почек, или из-за повышенного содержания фруктозы в пище.

Потребление богатой пурином пищи — это одна из основных причин гиперурицемии. Другая вызываемая едой причина — это потребление высококалорийной и жирной пищи и голодание. Результатом голодания бывает то, что для получения энергии начинает тратиться мышечная масса тела и высвобождаемые в процессе этого пурины попадают в кровообращение.

Содержание пуриновых оснований  в пище различно. Еда с высоким  содержанием пуриновых оснований  аденина и гипоксантина способствуют усилению гиперурицемии.

Человеку необходима урата оксидаза, энзим, который разрушает мочевую кислоту. Повышение уровня мочевой кислоты увеличивает предрасположенность к подагре и (при очень высоком уровне) почечной недостаточности. Независимо от обычных отклонений (с генетической составляющей), синдром распада новообразования вырабатывает критическое содержание мочевой кислоты, что почти всегда приводит к почечной недостаточности. Синдром Лёша-Нихена также взаимосвязан с критически высокими уровнями мочевой кислоты. Метаболический синдром часто представлен гиперурицемией.[3]

Лечение

Препарат "Aquaretics". Препарат "Аллопуринол" (200-300 мг перорально один раз в день), применение спорно. Уменьшение выработки мочевой кислоты в теле может вызвать застой мочевой кислоты в оргинизме и привести к нефролитиазису или подагре. Понижение кислотности мочи потреблением пищевой соды. Диета с низким содержанием пурина (смотрите подагра). Препарат "Фебуксостат".[3]

 

 

 

 

 

3.2 ТЕХНИКА ПОЛУЧЕНИЯ МОЧЕВОЙ КИСЛОТЫ

Мочевая кислота и техника её получения

Свойства:  Бесцветные кристаллы, разлагаются ниже температуры плавления, плохо растворимы в воде, этаноле, диэтиловом эфире. Растворимы в растворах щелочей, горячей серной кислоте и глицерине.

Mm = 168.12 г/моль

Тразл = 400оС

Hгор = 1919 кДж/моль

Является  двухосновной кислотой (pK1 = 5.75, pK2 = 10.3), образует кислые и средние соли —  ураты. Под действием концентрированных кислот и щелочей разлагается на хлороводород, аммиак, углекислый газ и глицин.

Легко алкилируется сначала по положению N-9, затем по N-3 и N-1.[4]

Открытие:   Мочевая кислота была открыта К.Шееле (1776) в составе мочи (отсюда название).

Лактим-лактамная  таутомерия:  Мочевая кислота существует в двух формах: лактамной форме и лактимной форме. Наиболее устойчива лактамная форма.

Биохимия  мочевой кислоты:  У человека и приматов — конечный продукт обмена пуринов (см. Пуриновые основания), образующийся в результате ферментативного окисления ксантина под действием ксантиноксидазы; у остальных млекопитающих мочевая кислота превращается в аллантоин. Небольшие количества мочевой кислоты содержатся в тканях (мозг, печень, кровь), а также в моче и поте млекопитающих и человека. При некоторых нарушениях обмена веществ происходит накопление мочевой кислоты и её кислых солей (уратов) в организме (камни в почках и мочевом пузыре, подагрические отложения, гиперурицемия). У птиц, ряда пресмыкающихся и большинства наземных насекомых мочевая кислота — конечный продукт не только пуринового, но и белкового обмена. Система биосинтеза мочевой кислоты (а не мочевины, как у большинства позвоночных) в качестве механизма связывания в организме более токсичного продукта азотистого обмена — аммиака — развилась у этих животных в связи с характерным для них ограниченным водным балансом (мочевая кислота выводится из организма с минимальным количеством воды или даже в твёрдом виде). Высохшие экскременты птиц (гуано) содержат до 25 % мочевой кислоты. Обнаружена она и в ряде растений.[4]