В последние два десятилетия в разных
странах разрабатываются и применяются
для массовых исследований специальные
программы.
Первый этап такой программы состоит в том, чтобы
среди большого количества обследуемых
выделит предположительно больных, имеющих,
какое-то наследственное отклонение от
нормы. Такая программа называется просеивающей,
или скриннинг-программой (англ. screening
— просеивание). Для этого этапа обычно
используется небольшое количество простых,
доступных методик (экспресс-методов).
Экспресс-методы основаны на простых качественных
реакциях выявления продуктов обмена
в моче, крови.
На втором этапе проводится уточнение (подтверждение
диагноза или отклонение при ложно-положительной
реакции на первом этапе). Для этого используются
точные хроматографические методы определения
ферментов, аминокислот и т. п.
Применяют также микробиологические
тесты, они основаны на том, что некоторые штаммы бактерий могут
расти только в средах, содержащих определенные
аминокислоты, углеводы. Удалось получить
штаммы по веществам, являющимся субстратамиили
промежуточными метаболитами у больных
при нарушении обмена. Если в крови или
моче есть требуемое для роста вещество,
то в чашке Петри вокруг фильтровальной
бумаги, пропитанной одной из этих жидкостей,
наблюдается активное размножение микробов,
чего не бывает в случае анализа у здорового
человека. Разрабатываются различные
варианты микробиологических методов.
Биохимические, иммунологические и другие
параклинические методы не являются специфичными
для генетической консультации, но применяются
так же широко, как и при диагностике ненаследственных
болезней. При наследственных болезнях
часто возникает необходимость применять
те же тесты не только у пациента, но и
других членов семьи (составление биохимической
или иммунологической "родословной")
24.Близнецовость у человека,
критерии определения идентичности близнецов.
Близнецовый метод в генетическом анализе.
Близнецы— дети одной матери, резвившиеся
в течение одной беременности и появившиеся
на свет в результате одних родов практически
одновременно. Близнецы могут быть как
однополые, так и разнополые.
Выделяют два основных типа
близнецов:
монозиготные (гомозиготные);
дизиготные (гетерозиготные).
Монозиготные (однояйцовые,
гомозиготные или идентичные) близнецы образуются из одной зиготы (одной яйцеклетки,
оплодотворенной одним сперматозоидом),
разделившейся на стадии дробления на
две (или более) части. Они обладают одинаковыми
генотипами. Монозиготные идентичные
близнецы всегда одного пола и обладают
очень большим портретным сходством.
Дизиготные близнецы развиваются в том случае, если две яйцеклетки
оплодотворены двумя сперматозоидами.
Естественно, дизиготные близнецы имеют
различные генотипы. Они сходны между
собой не более, чем братья и сестры, так
как имеют около 50 % идентичных генов.
Общая частота рождения близнецов
составляет примерно 1 %, из них около 1/3
приходится на монозиготных близнецов.
Для подтверждения
монозиготности близнецов, используют
ряд подходов:
сравнение по многим, главным образом,
морфологическим признакам - пигментация глаз, волос и кожи, особенности
волосяного покрова на голове и теле, а
также форма волос, форма ушей, носа, губ
и ногтей, пальцевые узоры (полисимптомный подход);
сравнение по эритроцитарным антигенам – группы крови АВО, резус, MN и др., по белкам и сыворотки крови: все перечисленные маркеры относятсяк категории моногенных менделирующих признаков, а контролирующие их гены отличаются узкой нормой реакции (иммунологический
подход);
сравнение данных ЭКГ и ЭГ- электрокардиографии и энцефалограмм - близнецов (клинико-функциональный метод);
трансплантационный тест, заключающийся
в перекрестной пересадке кожи у близнецов
(вариант иммунологического подхода, успешная
перекрестная пересадка – наиболее достоверный критерий монозиготности).
Близнецовый метод используется
для выяснения наследственной обусловленности
признаков и хорошо демонстрирует взаимоотношения
между генотипом и внешней средой. С помощью
этого метода удалось оценить значимость
генетической предрасположенности к многим
заболеваниям, пенетрантность, экспрессивность
и условия проявления тех или иных видов
патологии. Близнецовые данные оказываются
полезными для количественной оценки
степени генетической детерминированности
отдельных признаков, в связи с чем, близнецовый
метод можно считать одним из важных методов
количественной генетики.
Таким образом, близнецовый
метод позволяет количественно оценить
вклад наследственности (генотипа) и вклад
окружающей среды в развитие изучаемого
признака (болезни).
Близнецовый метод включает
следующие этапы:
Этап 1. Подбор
пар монозиготных и дизиготных близнецов.
Подбирают по 100 пар близнецов,
у которых хотя бы у одного
из двух близнецов имеется
изучаемый признак
Этап 2. Вычисление
степени сходства внутри каждой группы
близнецов.
Определяются отдельно для каждой группы
Конкордантность(К) – наличие признака
одновременно у обоих близнецов.
Дискордантность(Д) – наличие признака
только у одного близнеца из пары.
Коэффициент наследуемости H
H=
Мз- монозиготные
Дз- дизиготные
Формула
Хольцингера
Н+Е=1
Н- коэффициент наследуемости
Е- доля среды в формировании изучаемого
признака
Этап 3 Вычисление
доли генотипа и доли среды в развитии
изучаемого признака
Если НЕ преобладает влияние наследственности
Если НЕ определяющим фактором является
средовой.
25. Дерматоглифический
метод, его сущность и возможности использования
при генетическом анализе.
Дерматоглифика (гр. derma — кожа,
gliphe — рисовать) — это изучение рельефа
кожи на пальцах, ладонях и подошвенных
поверхностях стоп. В отличие от других частей тела здесь
имеются эпидермальные выступы — гребни,
которые образуют сложные узоры. Еще в
древности в Китае и Индии обратили внимание
на то, что рисунки кожных узоров на пальцах
и ладонях строго индивидуальны, и пользовались
отпечатками пальцев вместо подписи. На
земле нет двух людей с одинаковыми рисунками
на пальцах (кроме монозиготных близнецов).
В 1892 г. Ф. Гальтон предложил классификацию
этих узоров, позволившую использовать
этот метод для идентификации личности
в криминалистике.
Таким образом, выделился один
из разделов дерматоглифики — дактилоскопия
(изучение узоров на подушечках пальцев).
Другие разделы дерматоглифики — пальмоскопия
(рисунки на ладонях) и плантоскопия (изучение
дерматоглифики подошвенной поверхности
стопы).
В диагностике наследственных заболеваний
дерматоглифика применяется потому, что
физические признаки, каковыми являются
особенности кожного рисунка, у большинства
больных с наследственной хромосомной
патологией имеют своеобразные отличия.
Обследуя родителей, можно заподозрить
наследственное заболевание у их детей.
Сам метод чрезвычайно прост. Черная
типографская краска тонким слоем раскатывается
валиком на стекле. Ладонная поверхность
кисти прижимается к стеклу, а затем делается
отпечаток на белой бумаге. Полученный
отпечаток кожного рисунка больного и
его родственников оценивается качественно
и количественно.
Дерматоглифические исследования имеют
важное значение в определении зиготностиблизнецов,
в диагностике некоторых наследственных
заболеваний, в судебной медицине, в криминалистике
для идентификации личности.
На формирование дерматоглифических
узоров могут оказывать влияние некоторые
повреждающие факторы на ранних стадиях
эмбрионального развития. Так, при внутриутробном
действии вируса коревой краснухи у ребенка
наблюдаются некоторые отклонения в узорах,
сходные с таковыми при болезни Дауна.
Многие вопросы наследственной обусловленности
дерматоглифики и влияния факторов среды
на развитие этих структур в эмбриональном
периоде остаются невыясненными. В последние
годы метод дерматоглифики стали использовать
в клинической генетике. Этот метод применяется
в качестве дополнительного для подтверждения
диагноза хромосомных синдромов у людей
с изменениями кариотипа. Менее показательны
данные дерматоглифического анализа при
заболеваниях генной природы.
26.Молекулярно-генетический
метод, его современные возможности и
перспективы использования в медицине.
Молекулярно-генетические
методы - большая и разнообразная группа методов,
предназначенная для выявления вариаций
(повреждений) в структуре участка ДНК
(аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть
до расшифровки первичной последовательности
оснований. В основе этих методов лежат
генно-инженерные манипуляции с ДНК и
РНК. Исходным этапом всех молекулярно-генетических
методов является получение образцов
ДНК. Источником геномной ДНК могут быть
любые ядросодержащие клетки. На практике
чаще используют лейкоциты, хорион, амниотические
клетки, культуры фибробластов. Возможность
проведения молекулярно-генетического
анализа с небольшим количеством легкодоступного
биологического материала является методическим
преимуществом методов данной группы.
Выделенная ДНК одинаково пригодна для
проведения различных исследований и
может долго сохраняться в замороженном
виде. Во многих случаях для успешной диагностики
болезни достаточно исследовать небольшой
фрагмент генома. Выделение таких фрагментов
стало возможным благодаря открытию ферментов
- рестриктаз, которые разрезают молекулу
ДНК на фрагменты в строго определенных
местах.
Различают прямую и косвенную
ДНК-диагностику моногенных наследственных
болезней.
При прямой диагностике предметом
анализа являются мутации гена. В ДНК-диагностике в настоящее время
используются разнообразные прямые методы.
Наиболее просто обнаруживаются мутации,
изменяющие длину амплифицированных фрагментов
ДНК, которые выявляются при электрофоретическом
анализе. Для выявления точковых мутаций,
небольших делеций и инверсий в исследуемых
генах используют методы, при помощи которых
можно проанализировать уникальную последовательность
ДНК. Примером может служить метод секвенирования
- определение нуклеотидной последовательности
ДНК. Любые типы мутаций могут быть обнаружены
путем прямогосеквенирования мутантной
ДНК. Для некоторых генов, имеющих небольшие
размеры, этот метод с успехом применяется
как основной метод сканирования мутаций.
Главное преимущество прямых методов
диагностики - почти 100 % эффективность.
Основной недостаток прямых
методов состоит в том, что для их применения требуется знание
точной локализации патологического гена
в геноме, его экзон-интронной структуры
и спектра его мутаций. Такая информация
на сегодняшний день доступна далеко не
для всех моногенных болезней человека.
Косвенное выявление мутаций
применяется в тех случаях, когда нуклеотидная
последовательность гена еще не известна,
но имеется представление о положении
гена на генетической карте. Косвенная ДНК-диагностика сводится
к анализу полиморфных генетических маркеров
у больных и здоровых членов семьи. Маркеры
должны быть расположены в том хромосомном
регионе, где и ген болезни. Такими маркерами
могут быть участки ДНК, существующие
в популяции в нескольких аллельных вариантах.
Отличия могут быть по составу нуклеотидов,
по числу динуклеотидных повторов. На
основе вариабельности маркерных участков
ДНК можно дифференцировать материнское
или отцовское происхождение конкретного
варианта маркера, сцепленного с геном
болезни. Благодаря анализу полиморфных
генетических маркеров можно определить
и проследить в поколениях хромосому,
несущую патологический ген. Технические
приемы в косвенной диагностике те же,
что и в прямой диагностике (получение
ДНК, электрофорез и другие). Главный недостаток
косвенных методов диагностики - обязательное
предварительное изучение генотипа как
минимум одного пораженного родственника.
Косвенные методы не требуют знания структуры гена и спектра
мутаций в нем. Необходимо только иметь
сведения о его локализации. В этом состоит
основное преимущество этих методов. Кроме
того, методы косвенной диагностики информативны
практически для всех обратившихся семей,
поскольку всегда есть возможность среди
полиморфных маркеров, сцепленных с локусом
заболевания, найти информативный для
данной семьи.
Методы молекулярной
генетики позволяют:
• идентифицировать мутации в гене. Примером
выявления мутантного гена является диагностика
серповидно-клеточной анемии в эмбриональном
периоде. Фрагменты ДНК, полученные при
действии рестриктаз у здорового и больного,
сравниваются с помощью метода гибридизации
по Саузерну, при этом в качестве зонда
используется радиоактивно меченая ДНК
гена Р-глобина;
• диагностировать моногенное наследственное
заболевание путем определения нуклеотидной
последовательности генов (гемофилия,
гемоглобинопатия) и выявления мутантных
генов (фенилкетонурия, муковисцидоз);
• осуществлять генетический анализ
полиморфизма ДНК родителей и детей;
• определять индивидуальную изменчивость
ДНК человека по вариабельным точкам ДНК,
молекулярный анализ которых по-зволяет
проводить идентификацию личности человека);
• выделять и синтезировать гены (выделение,
синтез и кло-нирование генов является
одним из этапов генной инженерии):
а) выделение генов: получение определенных
фрагментов ДНК с помощью рестриктаз:
разделение фрагментов по молекулярной
массе и электрическому заряду —» определение
длины фрагмента —> выявление нуклеотидной
последовательности данного гена;
б) синтез генов (варианты): химический
синтез — синтез опре-деленных последовательностей
нуклеотидов, соответствующих данному
гену (используют генетический код и по
известной последовательности аминокислот
химическим путем синтезируют последовательность
ДНК). Ферментативный синтез — с помощью
фермента обратной транс - криптазы (ревертазы)
на матрице мРНК синтезируют комплементарную
ДНК.
Существенно изменились принципы медико-генетического
консультирования: благодаря ДНK-диагностике
у неврологов появилась возможность раннего
выявления носителей мутантного гена
и в ряде случаев проведения превентивной
терапии на пресимптоматической стадии
болезни. Более того, проведение пренатальной
ДНК-диагностики позволяет в настоящее
время достоверно оценивать генетический
статус плода п при необходимости рекомендовать
прерывание беременности, способствуя
профилактике повторных случаен заболевания
в отягощенных семьях. Новейшей страницей
профилактики наследственной неврологической
патологии является разработка методов
преимплантациопной ДНК-диагностики.
27.Гибридологический
анализ, его использование в генетических
исследованиях.