Нирки та сеча щурів

 

 

Таблиця 2.5.

Запуск реакції зразком

 

Температура		Плюс 25ºС   чи плюс 30ºС				Плюс 37ºС
Піпетувати,мкл		макро		мікро		макро		мікро
Монореактив ( Р1)+(Р2) Зразок		5000 100		1000 20		5000 50		1000 10
В обох випадках перемішати,визначити  абсорбцію інкубаційної суміші 1,2 і 3 хв проти повітря або дистильованої  води. Обчислити швидкість зміни  оптичної щільності реакційного  розчину- ΔΕ/хв.
Запуск реакції субстратом	Плюс 25ºС або 30ºС				Плюс 37ºС
Довжина хвилі,нм	Макро		Мікро		Макро		Мікро
340 334 365	8095 8250 15000		10080 10275 18675		16030 16345 29705		20000 20390 37060
Запуск реакції зразком	Плюс 25ºС  або 30ºС				Плюс 37ºС
Довжина хвилі,нм	Макро або мікро				Макро або мікро
340 334 365	8095 8250 15000				16030 16345 29705

 

Таблиця 2. 6.

Схема проведення аналізу з субстратом

 

 

Запуск реації субстратом	Плюс 25ºС або 30ºС			Плюс 37ºС
Довжина хвилі,нм	Макро		Мікро	Макро		Мікро
	134,92 137,50 250,00		168,0 171,25 311,25	267,17 272,42 495,08		333,33 339,83 617,67
Запуск реакції зразком		Плюс 25ºС або 30ºС			Плюс 37ºС
Довжина хвилі,нм		Макро або мікро			Макро або мікро
340 334 365		134,92      168,0 137,50     171,25 250,00        311,25			267,17      333,33 272,42       339,83 495,08       617,67

 

2.6. Метод визначення активності гама-глутамілтранспептидази в гомогенаті та сечі щурів

 

Визначення активності гама-глутамілтранспептидази проводили за допомогою діагностичних наборів реактивів виробництва «Філісіт-Діагностика» (Україна, Дніпропетровськ).

Принцип методу: під дією гамма-глутамілтранспептидази глютаміновий залишок з γ  L(+)-глутаміл-4-нітроаніліда переходить на діпептидний акцептор-гліцилгліцин. При цьому вилучається хромоген 4-нітроаналін.

Оптичну щільність реакційного  розчину вимірюють після гальмування ферментативної реакції оцтовою кислотою.

Реактиви:

1.Буферний розчин рН ( 8,0-8,3)                          1 флакон з ( 50±2) мл

-гліцилгліцин (0,5±0,005) ммоль/л

-тріс(гідроксиметил)мінометан( 0,5±0,05) моль/л

2.Оцтова кислота                                              2 флакони по ( 50±2) мл

3.Калібратор 

  П-нітроанілін ( 5,4±0,06) ммоль/л                     1 ампула (5,1±0,5) мл

4.Субстрат наважкою  або у розчині ( 10±0,5) мл       4 мікропробірки

γ-L-глутамілнітроанілід ( 240±5)                           1 флакон

 

Проведення аналізу  проводили за схемою,описана в  табл.2.7.

 

Таблиця 2.7.

Схема проведення аналізу 

Відміряти у пробірку,мл		Макро аналіз													Напів мікро аналіз
		Дослідна проба		Холоста проба			Калібрувальна проба				Проба порівняння				Дослідна проба		Холоста проба					Калібрувальна проба				Проба порівняння
Робочий субстрат ний  розчин		1,0		1,0			1,0				1,0				0,5	0,5			0,5				0,5
Інкубують 5 хв при температурі плюс 37ºС
Сироватка крові	0,10				-			-		-			0,5					-		-					-
Інкубують точно 15 хвилин притемпературі плюс 37 ºС
Калібратор Розчин оцтової кислоти Сироватка крові Дистильована вода			-   6,00     -     -			-   6,00     0,10     -			0,05   6,00     -     0,05			-   6,00     -     0,1		-   3,00     -     -		0,05   3,00     -     0,025					-   3,00     -     0,05			-   3,00     0,05     0,05

 

 

  Витримують 5 хв  при кімнатній температурі.Вимірюють оптичну щільність дослідної проби Едосл- проти холостої проби.Оптичну щільність калібрувальної проби-проти проби порівняння.Забарвлення стабільне протягом 30 хв.

 

Розрахунок результатів:

Розрахунок результатів ведуть за формулою:

С= Едосл/Екал  · 3,0 мккат/л,де

С-активність гамма-глутамілтранспептидази,мкат/л

3,0-фактор перерахування,мкат/л

Едосл-оптична щільність дослідної проби,од.оптичної щільності

Екал-оптична щільність калібрувальної проби,од.опт.щільності

мкмоль( с ·л)=мкат/л=60 Мод/л( U/L)=3,6мкмоль/(год·мл)

 

2.7.Статистична  обробка результатів

 

Статистичну обробку  проводили з використанням програми Microsoft Exel з використанням методів  математичної статистики, які розроблено для малих вибірок. Визначали середнє арифметичне , як більш вірогідне значення вимірюваної величини за формулою: , де Σ- знак суми,  Хi – результати окремого спостереженя, n – число варіанту.

З метою кількісної оцінки мінливості розраховували середнє  квадратичне відхилення: , де δ – середнє квадратичне відхилення, Хi - результати окремого спостереженя, n – число спостережень.

Середню квадратичну  похибку сердньох арифметичної визначали  за формулою:  , де m – середня похибка, δ – середнє квадратичне відхилення,  n – число варіантів [26].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РОЗДІЛ III. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

3.1. Зміна функціонального стану нирок при розвитку пухлини

 

За результатами дослідження  було встановлено, що розвиток пухлини призводив до збільшення ваги нирок відносно ваги тіла щурів на 20% (в 1,2 рази) (рис.3.1).

^{* –  Р<0,05, відносно контрольної групи}

             Рис.3.1. Відносна вага нирок щурів, %

 

Введення всіх дослідних  сполук зберігало цей показник на рівні групи Т8, а введення змішаних наночасток збільшувало відносну вагу нирок на 175% (в 2,75 рази), порівняно з контролем.

Такі зміни підтверджуються  результатами досліджень, що вказують на збільшення відносної ваги нирок  в 1,3 рази на десятий день після одноразового введення cPt щурам [52]. Це явище детально описано у сучасній нефрології і має назву компенсаторної гіпертрофії нирок [46]. Вважають, що збільшення ваги нирок пов’язане із адаптивним збільшенням розмірів нефрону, яке відбувається у відповідь на часткову втрату функціонуючих нефронів. Цей процес активується при дії токсичних речовин і ліків, метаболічних розладах організму, а також захворюваннях (цукровий діабет, пухлини, хвороби нирок) [29].

Існує думка, що головним механізмом ниркової гіпертрофії є  прискорення синтезу протеїнів (структурні компоненти, сполучна тканина, ензими, стресові білки) та/або зниженням швидкості їхньої деградації [54]. Це є основною адаптивною відповіддю клітин на ушкодження, яка розвивається вже на 3 день після введення різних нефротоксикантів такі як протипухлинні сполуки, антибіотики, солі важких металів та інші [46].

Активація компенсаторних механізмів при токсичному ушкодженні нирок проявляються у прискоренні швидкості потоку плазми в гломерулах і підвищенням гломерулярного гідравлічного тиску [33,29].  Це має довготривалі шкідливі наслідки для нефронів, що зберегли свою цілісність, оскільки в кожному окремому нефроні відбувається зростання швидкості фільтрації, а також реабсорбції води і розчинених речовин [34]. Як наслідок, змінюється проникність плазматичних мембран, швидкість біохімічних процесів і хімічний склад внутрішньоклітинного і позаклітинного середовищ. Однією з найбільш достовірних ознак ураження паренхіми нирок є екскреція протеїнів з сечею (протеїнурія). За вираженістю протеїнурії оцінюють ступінь активності ураження нирок [46,51].

За результатами дослідження було встановлено, що розвиток пухлини призводив до збільшення концентрації загального білку в сечі на 145,7% (в 2,5 рази), порівняно з контролем (рис.3.2).

   Рис.3.2.Зміна концентрації загального білку в сечі, мк/л

      _{* - P<0,05, відносно групи Т8}

 

За результатами дослідження  було встановлено, що розвиток пухлини  призводив до збільшення концентрації загального білку в сечі на 145,7% (в 2,5 рази), порівняно з контролем.

Хоча, за літературними  даними введення cPt щурам у терапевтичній дозі викликає збільшення концентрації  протеїнів у сечі в 2 рази [51], нами не було знайдено даних щодо зміни цього показника. Нефротоксична дія cPt перш за все пов’язана зі специфічним накопиченням сполук платини в нирках. Є дані щодо наявності кореляції між акумуляцією платини в корі нирок і кількістю ушкоджених клітин [35]. Цей протипухлинний засіб переважно накопичується у нирках в перші 24 години і його концентрація зберігається впродовж наступних 72 годин, після чого відбувається повне виведення препарату з організму [55]. Отже, можна припустити, що по мірі виведення cPt з нирок відбувається регенерація ниркової тканини і поновлення їхнього функціонування та біохімічних процесів. Але, механізм протеїнурії складний і має багато причин. На ранніх стадіях розвитку більшості нефропатій до сечі потрапляють переважно низькомолекулярні плазматичні білки. Це обумовлено порушенням процесів фільтрації і ушкодженням гломерул (гломерулярна протеїнурія), або може бути пов’язане з канальцевим ушкодженням і змінами у процесі реабсорбції (тубулярна протеїнурія) [41,52]. Визначення ж протеїнів з високою молекулярною вагою більш характерно для вираженого ураження нирок [41]. Окрім цього, поява білків у сечі можлива через збільшення концентрації низькомолекулярних білків у плазмі крові (легкі ланцюги імуноглобулінів, гемоглобіну і міоглобіну), порушення у статевих залозах [41,52].

Тому, хоча цей показник найпершим реагує на будь-які зміни  ниркового гомеостазу, але може використовуватись  лише у якості загального маркеру  стану сечостатевої системи, оскільки не вказує ні на ступінь ушкодження, а ні на локалізацію ушкодження [39].

Нефротоксична дія лікарських засобів та хімічних сполук часто носить локальний характер[38]. Більшість нефропатій, що супроводжуються протеїнурією асоційовані з прогресивним запаленням гломерул, що в кінцевому результаті призводить до їхнього лізису [55].

 

3.2. Зміна концентрації  креатиніну в плазмі та сечі  щурів

 

Стандартним маркером ушкодження гломерулярного апарату є рівень креатиніну в плазмі крові [35,46]. Ця сполука утворюється шляхом неферментативної дегідратації м’язового креатину. При цисплатиновій інтоксикації у тварин і людей концентрація цієї речовини збільшується в 2-3 рази вже через 2 доби [53], а найбільша концентрація відмічається на 4-5 добу після введення cPt у дозі 7,5 мг/кг. В цей період рівень креатиніну в плазмі крові збільшений у 5 разів порівняно з контрольною групою. В подальшому відбувається компенсаторне відновлення функції нирок і вже на сьому добу цей показник знижується вдвічі [41].

За результатами нашого експерименту, при розвитку пухлини і при корекції патологічного стану cPt відмічалось збільшення рівня креатиніну в плазмі крові порівняно з контрольною групою в 1,2 і 1,5 рази відповідно (рис.3.1).

 

Рис. 3.1. Концентрація ендогенного креатиніну в плазмі та сечі    щурів та кліренс креатиніну, мкл/хв

               ^{* – Р<0,05, відносно контрольної групи, # – Р<0,05, відносно контрольної групи}

Отримані дані вказують на  зменшення кліренсу креатиніну при розвитку пухлини на 30%,порівняно з контролем.

Введення cPt у розчині знижувало цей показник в 2,2 рази порівняно з групою Т8. Групі якій  вводили цисплатин у наноліпосомах цей показник  наближався до значення  групи тварин з пухлиною.

Визначення кліренсу ендогенного креатиніну використовують для визначення швидкості гломерулярної фільтрації. Цей показник враховує зміни концентрації креатиніну в плазмі та сечі з урахуванням об’єму утвореної сечі за певний проміжок часу [35]. Вважається, що рівень очищення крові від цієї сполуки наближається до рівня істинної фільтрації в гломерулах. Основною перевагою цього показника є те, що він не залежить від дієти, фізичного навантаження або ушкодження м’язової тканини [44]. Більшість авторів при описанні захворювань нирок дотримуються думки, що при лікуванні онкологічних хворих цитостатиками відбувається зниження швидкості гломерулярної фільтрації [40,34].