Нирки та сеча щурів

Опущення нирки може бути діагностовано за допомогою порівняння активності лактатдегідрогенази в сечі, що продукується при вертикальному положенні пацієнта, з сечею, що продукується в лежачому стані; при опущенні, утворена сеча містить набагато більшу ферментативну активність.

Виключно висока активність сечової лактатдегідрогенази зустрічається  у хворих зі злоякісними пухлинами  урогенітального тракту – рак нирки, рак сечового міхура , а також рак шийки матки і рак передміхурової залози . Ці результати говорять про великий серії досліджень для визначення наявності активності сечової лактат дегідрогенази, що може бути використана як маркер злоякісних пухлин сечостатевої системи, а в деяких випадках, навіть при скритих карциномах (без патологічних змін в сечі) свідчили про підвищення активності сечової лактат дегідрогенази [10,2,7].

Однак ці результати не можуть ствреджувати про діагностичну цінність визначення сечової лактатдегідрагенази для  злоякісних новоутворень в урогенітального  тракту:

- Лактатдегідрогеназна активність в сечі не підвищується в кожному конкретному випадку, а в деяких серіях, відсоток був нижче за 75% ;

- Відсутність істотної різниці у рівні активності сечової лактат дегідрогенази при злоякісних і доброякісних утвореннях в урогенітальному тракті;

- Збільшення активності сечової лактат дегідрогенази у хворих на злоякісні новоутворення урогенітального тракту обумовлено насамперед неспецифічними факторами (запалення, клітини крові в сечі, прискорений обміну в нормальних клітинах) і лише в малому ступені підвищенням виділенням в сечу лактатдегідрогенази з пухлинних клітин , що було підтверджено комбінованими біохімічними і цитологічними дослідженнями  [19,8,21].

Сьогодні, визначення активності сечовогї лактатдегідрогенази здається цінним скринінг-тестом на виявлення наявності злоякісних пухлини сечостатевого тракту, але тільки за відсутністю піурії (наявність гною в сечі при запальних процесах, наприклад запалення легень, нирок і т.д.).

 

1.8. Профілактика та лікування нефротоксичної дії

 

З метою зниження ризику розвитку медикаментозної нефротоксичності лікар має бути добре поінформований про небажані впливи лікарських засобів  на функцію видільних органів, уникати призначення потенційно небезпечних лікарських засобів  без очевидної потреби (у разі ж необхідності – призначати на якнайкоротший строк) [13,24,4].

Лікувальна тактика в разі виникнення ураження нирок здебільшого полягає у припиненні введення відповідного підозрюваного лікарського засобу. Преренальні ушкодження потребують обов’язкового відновлення об`єму циркулюючої крові. Внутрішньониркові ушкодження (наприклад, тромботична мікроангіопатія, холестеринові емболи, тубулярний некроз, рабдоміоліз) поряд із припиненням уведення підозрюваного лікарського засобу та підтримувальною терапією передбачають проведення плазмоферезу за показаннями. У частині випадків для компенсації функції нирок відміна лікарських засобів виявляється недостатньою і хворі потребують проведення гемодіалізу.

При обструктивних ураженнях нирок (кристалурії, нефролітіазі) поряд зі зниженням дози або повною відміною лікарських засобів слід проводити залуження сечі (особливо в разі використання сульфаніламідів). Хронічні ураження нирок, зокрема облітеруючу артеріопатію і фіброз сечоводів, лікують, за можливості, зниженням дози підозрюваного  лікарського засобу та підтримувальною терапією [2,7].

При порушеннях електролітного балансу та нефрогенному нецукровому діабеті, крім припинення вживання нефротоксиканта, на фоні підтримувальної та відновлювальної терапії необхідна корекція вмісту калію та натрію: обмеження вживання рідини в разі гіпонатріємії, призначення препаратів калію та магнію при дефіциті останніх, низькокалійна дієта в разі гіперкаліємії. Метаболічний алкалоз потребує відновлення об’єму циркулюючої крові, тубулярний ацидоз – заміщення HCO₃–.

Однак слід зазначити, що наразі в арсеналі лікаря практично відсутні специфічні ЛЗ, які б запобігали побічним      нефротоксичним реакціям або лікували їх (пошуки в цій галузі ще не вийшли за межі експериментальних досліджень). Такий підхід (підтримувальна терапія) з успіхом використовується в онкологічній практиці при застосуванні високотоксичних засобів хіміотерапії [26,13].

Таким чином, небажана та токсична дія ксенобіотиків на функцію видільних органів залишається досить серйозною проблемою, що пов’язано з різноманітністю проявів та відсутністю дієвих засобів терапії цієї патології. Тому сьогодні основним шляхом розв’язання вказаної проблеми є раціональне використання потенційних нефротоксикантів, у тому числі й медикаментозного походження, а також пошук лікарських засобів  для зменшення або усунення нефротоксичності.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Розділ II.  Матеріали та методи

 

2.1. Збір  сечі у дослідних тварин

 

Збір сечі у дослідних тварин проводили вранці, натще, в умовах індукованого діурезу із використанням  1% водного навантаження відповідно до методики описаної Берхіним Є. Б. та Івановим Ю. І. у 1972 році [29].

 

2.2.Приготування плазми крові

Одержання плазми крові

           

Кров  беруть натщесерце з вени гострою сухою голкою з широким діаметром, без шприца (для запобігання гемолізу). При заборі крові перші 5-6 крапель відкидають.

  Для цілей отримання плазми крові в пробірки додають літієву або натрієву сіль гепарину в пропорції до що забирається в пробірку кров'ю 15-20 МО/1 мл, що є гарантією повної інактивації згортання крові і не спотворює досліджувані параметри. Еритроцити зберігаються в зразку крові до 8 годин. Не можна використовувати для проведення аналізів зразки крові, що зберігався більше 48 годин навіть в умовах холодильника (+4ºС). Для отримання якісного результату аналізу необхідно: негайно після взяття крові обережно перевернути пробірку 5-7 разів для кращого перемішування крові і гепарину. Плазма відділяється після центрифугування. Нормальні швидкості центрифугирования - 1000-1500G (2000-3000 про/хв). При необхідності допускається центрифугування з прискоренням 4000G c кришечкою та до 12000G без кришки [2,30].

 

 

 

2.3. Метод визначення концентрації загального білку у сечі щурів

Визначення концентрації загального білку проводили за допомогою  діагностичних наборів реактивів  виробництва «Філісіт-Діагностика» (Україна, Дніпропетровськ). Принцип  методу полягає у реакції білків з пірогалоловим червоним/молібдатом забарвлений комплекс. Інтенсивність забарвлення реакційного розчину прямо пропорційна концентрації білків в аналізуємому розчині [5].

Реактиви:

Монореагент:

50,0 ммоль/л пірогалолового  червоного

0,040 ммоль/л молібдату натрію

Калібрувальний розчин альбуміну 1 г/л

Хлорид натрію 0,9%

 

Хід визначення:

Перед аналізом зразки свіжозібраної  сечі центрифугували при 900 g і перевіряли рН. Визначення концентрації білку проводили згідно схеми, представленої в таблиці 2.1.

Таблиця 2.1.

Схема визначення білку в сечі

Відміряємий розчин, мл	Дослідна проба	Калібрувальна проба	Холоста проба
Монореагент	1,00	1,00	1,00
Аналізуємий розчин	0,02	-	-
Калібрувальний розчин	-	0,02	-
Дистильована вода	-	-	0,02
Перемішати, витримати 10 хв при кімнатній температурі, фотометрувати проти холостої проби при довжині хвилі 540 нм. Забарвлення стабільне протягом 30 хв.

 

Розрахунок концентрації глюкози проводили за формулою:

С=1000× Е_оп/Е_кал (мг/л),

де С – концентрація білку у дослідній пробі, мг/л;

1000 – концентрація  білку в калібрувальному розчині,  мг/л;

Е_оп – оптична щільність дослідної проби, од. опт.щільності;

Е_кал – оптична щільність калібрувальної проби, од. опт.щільності;

Достовірність отриманих  результатів контролювали за допомогою атестованої контрольної сироватки «Філісіт–КГБС» (Україна).

 

2.4. Метод визначення концентрації креатиніну в плазмі крові та сечі щурів

Визначення креатиніну проводили за допомогою діагностичних  наборів реактивів виробництва  «Філісіт-Діагностика» (Україна, Дніпропетровськ). Принцип методу полягає у реакції пікринової кислоти з креатиніном і утворенні у лужному середовищі продукт жовтого-червоного кольору (похідне 2,4,6-три-нітроциклогексадієну). Інтенсивність забарвлення дослідного розчину прямо пропорційна концентрації креатиніну у пробі. У сироватці крові креатинін досліджується після депротеїнування розчином три хлороцтової кислоти, у сечі – після розведення [5,8].

Реактиви:

0,04 моль/л розчин пікринової  кислоти

1,22 моль/л розчин три  хлороцтової кислоти

1,15 Н гідроокис натрію

442, 4 мкмоль/л калібрувальний  розчин креатиніну

Визначення концентрації креатиніну проводили згідно з таблицею 2.2.

Таблиця 2.2.

Схема проведення аналізу в плазмі крові

Відміряємий розчин, мл	Дослідна проба	Калібрувальна проба		Холоста проба
Сироватка	0,5	–		–
Дистильована вода	1,0	1,0		1,5
Калібрувальний розчин	–	0,5		–
Розчин ТХО кислоти	0,5	0,5		0,5
Перемішати, центрифугувати 5 хв при 3000об/хв
Надосадова рідина	1,0	1,0		1,0
Розчин гідроокису натрію	0,5	0,5		0,5
Розчин пікринової к-ти	0,5	0,5	0,5
Перемішати, витримати 20 хв при кімнатній температурі, фотометрувати  проти холостої проби. Забарвлення  стабільне протягом 20 хв.

 

Визначення концентрації креатиніну в сечі проводили згідно з таблицею 2.3.

Таблиця 2.3.

Схема проведення аналізу в сечі

Відміряємий розчин, мл	Дослідна проба	Калібрувальна проба	Холоста проба
Дистильована вода	–	2,0	–
Калібрувальний розчин	–	1,0	–
Розчин ТХО кислоти	–	1,0	–
Перемішати, центрифугувати 5 хв при 3000об/хв.. Перед аналізом розвести сечу у 100 разів (до 1 мл сечі додати 99 мл дистильованої води).
Надосадова рідина	–	2,0	–
Розведена сеча	1,0	–	–
Розчин ТХО кислоти	0,5	–	0,5
Дистильована вода	0,5	–	1,5
Розчин гідроокису натрію	1,0	1,0	1,0
Розчин пікринової кислоти	1,0	1,0	1,0
Перемішати, витримати 20 хв при кімнатній температурі, фотометрувати  проти холостої проби при 440 нм. Забарвлення  стабільне протягом 20 хв.

Розрахунок концентрації креатиніну у пробі проводять  за формулою:

С= Е_дос/Е_кал *442, де

 

С – концентрація креатиніну в пробі, мкмоль/л

442 – калібрувальна  концентрація креатиніну, мкмоль/л

Е_дос – оптична щільність дослідної проби, од. опт. щільності

Е_кал – оптична щільність калібрувальної проби, од. опт. Щільності

 

2.5. Метод визначення загальної активності лактатдегідрогенази в гомогенаті та сечі щурів

Визначення активності лактатдегідрогенази  проводили за допомогою діагностичних наборів реактивів виробництва «Філісіт-Діагностика» (Україна, Дніпропетровськ).

Принцип методу базується на оптимізованому стандартному методі відповідно до вимог DGKS ( Німецького Товариства Клінічної Хімії ) і модифікований відповідно до рекомендацій SCE ( Скандинавського комітету по ензимам)  [5,8].

Піруват+НАДН+Н←→Лактат+НАD+

          НАДН та NAD- дві форми β-нікотинамін аденін дінуклеотиду

Піруват перетворюється   в лактат з одночасним окислюванням НАДН.Швидість зменшення абсорбції  при 340 нм,що зв`язана з окислюванням НАДН,прямо пропорційна активності ЛДГ у пробі [5].

Реактиви:

1.Буферний розчин ЛДГ  (P1) ph ( 7,4 ± 0,2) – 4 флакони з ( 20±1) мл

- ТРІС( 62,5± 3,125) ммоль/л;

- Піруват ( 1,5±0,075) ммольл;

-ЕДТО ( 6,25 ±0,3125) ммольл;                       1 флакон з (20±1)мл;

2.Стабілізуючий  розчин

-гідроокис натрію 0,01 Н

3.Субстрат НАДН                                       1 мікропробірка з ( 16±2)мг

 

Проведення аналізу:

Перед початком реакції  кювету  і розчини нагріти до необхідної  температури протягом 5 хв.При вимірюванні оптичної щільності  потрібно підтримувати постійну температуру ( ±0,5ºС).

Дослідження проводили  за схемами,що представлені в таблицях 2.4., 2.5, 2.6.

 

 

Таблиця 2.4.

Запуск реакції з  субстратом

Температура	Плюс 25ºС чи плюс 30ºС				плюс 37 ºС
Піпетувати,мкл	макро		мікро		макро		мікро
Буферний розчин ( Р1) Зразок	4000     100		1000     20		4000     50		1000     10
Перемішати,інкубувати 1 хв,потім додати
Розчин субстрату (Р2)		1000		250		1000		250