Метод електрофорезу в дослідженні біологічних об’єктів

Так як рухливість поділюваних компонентів досліджуваної суміші в електричному полі нижче рухливості «швидких» іонів і вище -

«Повільних» іонів , то в просторі з різким падінням напруги вони також прискорюються і на кордоні двох іонних фронтів концентруються в

тонку смужку.

На кордоні між концентрирующим Великопористий гелем і дрібнопористі розділяє гелем іони загальмовуються в результаті молекулярно- ситового ефекту : чим більше молекулярна маса , тим повільніше речовина проходить через невеликі пори розділяє гелю. При цьому «повільний» гліцинат - іон випереджає іони білкового зразка , так як маса гліцинат відносно мала, і створює позаду себе простір з падінням напруги. " Запізнілі " (порівняно з гліцинатом ) іони зразка змушені просуватися в цьому утвореному « повільними » іонами просторі. Крім того , в буфері розділяє гелю , що має рН 8,8 , диссоциируют кислотні угруповання білків і білки різної будови набувають різний за величиною негативний заряд, що змушує їх рухатися до анода зі швидкістю , пропорційною заряду. У підсумку черезвідмінності поділюваних білків як за масою , так і по заряду , вузька стартова зона руйнується , утворюючи в розділяючому гелі зони окремих білків - компонентів суміші.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РОЗДІЛ 3. ПРАКТИЧНЕ ЗАСТОСУВАННЯ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ

 

3.1. Проведення нативного вертикального диск- електрофорезу в пластині ПААГ з використанням приладу Стадіера

 

 

Нативний електрофорез служить для розділення не підданих денатурації білків. Електрофоретична рухливість білка в нативному стані залежить одночасно і від його сумарного заряду , і від молекулярної маси, і від конфігурації поліпептидного ланцюга. Для встановлення суворої кількісної кореляції між одним з цих параметрів і електрофоретичної рухливістю білка потрібно виключити вплив всіх інших.

Реактиви:

1 . Сток - розчин АБ для  приготування гелю ( 100 мл). 30 % акриламід

- Бісакріламід : наважку 29.6 г акриламіду розчиняють у  невеликій кількості води , додають 0,4 г Бісакріламіда , розчиняють і доводять об'єм

до 100мл Розчин зберігають в темній склянці в холодильнику.

2 . Буфер для приготування  концентрирующего гелю ( 25 мл). Тріс- HCl буфер 0,625 М , рН 6,8 . Наважку трис  розчиняють у половинному обсязі води ( 12 мл) , рН розчину при перемішуванні доводять до потрібного значення за допомогою концентрованої соляної кислоти. Потім водою доводять об'єм розчину до потрібного значення .

3 . Буфер для приготування  розділяє гелю ( 50 мл). Тріс- HCl буфер 1,5 М , рН 8,8.

4 . Персульфат амонію ( ПСА ) . 10 % ( 1 мл). Готують в день приготування  гелю.

5 . ТЕМЕД . У нейтральній  і лужної середовищах його  можна вносити в кількості , еквімолярних  стосовно персульфат . При полімеризації  в кислому середовищі зміст  ТЕМЕД слід значно збільшити.

6 . Розчин для приготування  агарозного гелю ( 50 мл). 2 %-ний розчин  агарози , приготований на розчині  електродного буфера.

7 . Електродний буфер ( 500 мл). 0,025 трис - 0 , 192 М гліцин , рН 8,3 .

8 . Барвник - " свідок" ( мітчик ) ( 0,5 мл). На електродному буфері готують розчин, що містить 0,001 %-ний бромфенолового синього ( рис. 5 ) і

10 % сахарози або гліцерину.

 

Рис . 5 Бромфеноловий синій

 

Обладнання

1 . Камера для вертикального  електрофорезу (прилад Стадіера ) в

комплекті з джерелом постійного струму ( рис. 6 ) .

2 . Комплект обладнання  для формування гелю: скла (однакові  по ширині , але різні по довжині ) , спейсери , гребінка , скотч , канцелярські  затискачі , вазелін (рис. 7 ) , скальпель , ножиці.

3 . Хімічні колби , склянки , пластикові пробірки на 50 мл , автоматичні піпетки - дозатори регульованого обсягу , одноразові шприци на 20 мл .

4 . РН- метр.

5 . Хроматографічна або  фільтрувальний папір - 0,5 аркуша.

6 . Холодильна камера.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 6 Прилад Стадіера для електрофорезу у вертикальних пластинах

 

Рис. 7 Комплект обладнання для електрофорезу 

 

Монтують скельця, створюючи обсяг, в якому буде полимеризоваться пластина гелю. Хід роботи з монтажу стекол показаний на рис. 8 А-В.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 8А Підбір стекол і спейсеров для електрофорезу

 

 

Підбирають скельця однакової товщини і ширини, але різної довжини. Розміри стекол задає ширина і висота електрофоретичної камери, але нижнє скло повинне бути довше верхнього. У нашому випадку висота нижнього  

 

скла 83 мм, верхнього - 73 мм. Ширина стекол - 102 мм. Спейсери змащують вазеліном і накладають на нижню (більше довге) скло з лівого і правого боку. Відстань від краю скла до спейсеров має бути 1-1,5 см. Верхнє скло обережно накладають поверх спейсеров і притирают.

Рис. 8Б Заклеювання скотчем країв стекол для електрофорезу

 

 

Дуже ретельно заклеюють широким скотчем спочатку нижню сторону, потім бічні сторони стекол. Полегшити цей процес допомагають канцелярські затискачі. Скотч повинен рівно і в натягу лягати на краю стекол. Верхній край НЕ заклеюють.

Рис . 8В Створення агарозних « бортів »

 

 

Створюють агарозном " борта " майбутньої пластини. Для цього затиски зміщують на нижню сторону , додатково зміцнюючи ними скотч. Піпеткою з відбитим носиком поступово ( порціями) , швидко (поки агароза не застигла ) і 

 

дуже акуратно заливають теплий рідкий агарозном гель між стекол з

бічних сторін ( між спейсером і краєм пластини) .

 

 

Другий етап . Полімеризація поліакріламідного гелю і заповнення стекол гелем.

 

1 . Розділяючий гель ( 12,5 %)

У пластиковій пробірці на 50 мл послідовно змішують : 8,3 мл

розчину АБ ,

5 мл буфера для розділяє  гелю ( Тріс- HCl , рН 8,8 ) , 6,6 мл води ,

24 мкл ТЕМЕД ,160 мкл ПСА .

Відразу після внесення ПСА пробірку закривають і ретельно перемішують вміст протягом 1 хв . Потім швидко набирають рідку гелеву суміш у шприц ( без голки ) і акуратно заповнюють нею простір між стекол (приблизно 2 / 3 об'єму) . Дають гелевою суміші застигнути (рис. 9А ) .

Кисень інгібує полімеризацію гелю , тому дегазація суміші

дозволяє прискорити полімеризацію гелю і знизити кількість ПСА і ТЕМЕД в 1,5-2 рази.

 

 

2 . Концентруйте гель

Готують суміш для концентрирующего гелю. Послідовно змішують в пластиковій пробірці на 50 мл :

1 мл розчину АБ ,1 мл  буфера для концентрирующего гелю ( Тріс- HCl , рН 6,8 ) , 3 мл води ,24 мкл ТЕМЕД ,160 мкл ПСА .

Рис. 9А Внесення гелевою суміші в простір між склом за допомогою шприца без голки  

 

Відразу після внесення ПСА закривають пластикову пробірку і ретельно перемішують вміст протягом 5-10 сек. Між стекол вставляють гребінку, змочену розчином ПСА, потім за допомогою шприца дуже швидко і обережно заливають рідку суміш в залишився обсяг між склом. Дають гелю застигнути. Отриману пластину гелю можна зберігати протягом доби в холодильнику.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис . 9Б Пластина ПААГ , підготовлена ​​для електрофорезу

 

 

Третій етап . Внесення зразків

 

Для електрофоретичного розділення використовуються проби , підготовлені , як описано в Додатку. З заполімерізовавшейся пластини гелю витягують гребінку , що призводить до формування заглиблень в гелі ( " кишень " ) обсягом 40 мкл кожен. Зігнувшись перегородки між кишенями слід поправити голкою від шприца. У кожну кишеню автоматичною піпеткою вносять 30 мкл проби і 10 мкл розчину мітчика - бромфенолового синього ( рис. 10А ) .

Бромфеноловий синій потрібен для спостереження за ходом електрофорезу . Молекули цього барвника несуть заряд того ж знака , що і молекули білка , але не взаємодіють з ним. Швидкість міграції барвника трохи вище , тому він іде з фронтом фореза . Нижче нього білків немає.

Рис. 10А Внесення досліджуваних зразків і барвника в кишені гелю

 

 

Поверх скла маркером окреслюють межі кишень, надписують варіанти проб і лінії, по яких передбачається розрізати гель після електрофорезу (рис. 10Б).

Рис. 10Б Розмітка пластини

 

 

Четвертий етап. Підготовка електрофоретичної камери і проведення електрофорезу.

 

Звільнивши від канцелярських затискачів і скотча, скла з підготовленою гелевою пластиною встановлюють в прилад Стадіера (рис. 11А).

 

 

Рис. 11А Установка пластини в електрофоретична камеру

 

 

У верхню і нижню ванночки приладу наливають електродний буфер. З верхньої ванночки буфер повинен обов'язково надходити до проб в кишенях гелю через смужку хроматографічного паперу, як показано на рис. 11Б. Приєднують дроти: катод (-, червоний провід) підключають до верхнього електроду, анод (+, синій провід) - до нижнього.

Рис . 11Б Хроматографічна папір , накладена на поверхню проб , забезпечує надходження до них буфера з верхньої ванночки приладу Стадіера (вид зверху)

 

 

Зібрану електрофоретична камеру попередньо охолоджують. Для цього її поміщають в холодильник за 10-12 годин до проведення електрофорезу .

Для проведення електрофорезу на прилад Стадіера подають електричний струм з напругою 200 мВ , силою струму 12 мА. Після того , як фронт барвника підійде до нижнього краю пластини , прилад відключають від електроживлення , гель обережно виймають із стекол , розрізають на рівні частини і використовують для прояву та аналізу (див. розділ 3). 

 

3.2 . Проведення  нативного вертикального диск- електрофорезу  в пластині ПААГ з використанням  камери VE- 10

 

Сучасні модифікації приладу Стадіера більш зручні і прості в роботі. Прикладом сучасної електрофоретичної камери є модель VE- 10 . Вона дозволяє проводити електрофорез одночасно на двох пластинах гелю.

реактиви

1 . Сток - розчин АБ для  приготування гелю ( 100 мл). 30 % акриламід -

бісакріламід : наважку 29,6 г акриламіду розчиняють у невеликій кількості води , додають 0,4 г бісакріламіда , розчиняють і доводять об'єм до 100 мл . Розчин зберігають в темній склянці в холодильнику.

2 . Буфер для приготування  концентрирующего гелю ( 25 мл). Тріс- HCl буфер 0,625 М , рН 6,8 . Наважку трис  розчиняють у половинному обсязі  води ( 12 мл) , рН розчину при перемішуванні  доводять до потрібного значення  за допомогою концентрованої  соляної кислоти. Потім водою доводять об'єм розчину до потрібного значення .

3 . Буфер для приготування  розділяє гелю ( 50 мл). Тріс- HCl буфер 1,5 М , рН 8,8.

4 . Персульфат амонію ( ПСА ) . 10 % ( 1 мл). Готують в день приготування  гелю.

5 . ТЕМЕД ( 100 мкл) . У нейтральній і лужної середовищах його можна вносити в кількості , еквімолярних стосовно персульфат . При полімеризації в кислому середовищі зміст ТЕМЕД слід значно збільшити.

6 . Електродний буфер ( 500 мл). 0,025 трис - 0 , 192 М гліцин , рН 8,3 .

7 . Барвник - " свідок" ( мітчик ) ( 0.5 мл). На електродному буфері готують розчин, що містить 0,001 %-ний бромфенолового синього ( рис.5. ) І 10 % сахарози або гліцерину.

 

Обладнання:

1 . Камера для вертикального  електрофорезу (прилад Стадіера ) в  комплекті з джерелом постійного струму. Разом з камерою VE- 10 використовують джерело струму "Ельф- 4 " ( рис. 12).

 

Рис.12 Камера VE- 10 і джерело струму "Ельф- 4 "

 

2 . Комплект обладнання  для формування гелю: скла з  приклеєними спейсерами , дві гребінки , скальпель , ножиці.

3 . Хімічні колби , склянки , пластикові пробірки на 50 мл , автоматичні  піпетки - дозатори регульованого  обсягу , одноразові шприци на 20 мл .

4 . РН- метр.

5 . Хроматографічна або  фільтрувальний папір - 0,5 аркуша.

6 . Холодильна камера. 

 

Перший етап . Збірка камери.

 

Камера VE- 10 в розібраному вигляді ( рис. 13А ) складається з рамки , двох наборів стекол (з виїмкою і без виїмки) , чотирьох пластикових затискачів з гвинтами і ванночки для електродного буфера. Стекла без виїмки мають прікленние спейсери (рис. 13Б ) .

Рис. 13А Складові частини камери VE-10

Внутрішнє скло (з виїмкою) прикладають до гумовій прокладці рамки камери, зверху поміщають зовнішнє скло (без виїмки) як показано на рис. 14.

Рис. 14 Рамка камери із зібраними на ній стеклами

 

Стекла з обох сторін притискають пластиковими затискачами, закручують гвинти затискачів (рис. 15). Довга частина затискачів повинна бути спрямована вниз.

Рис. 15 Скло, притиснуті затискачами до рамки

 

Всі повторюють із зворотного боку рамки для іншого комплекту стекол. При необхідності другий комплект стекол може бути замінений заглушкою - товстим склом відповідного розміру.

Для заливки гелю використовують заливний столик (рис. 16А). Зібрану камеру поміщають на силіконову прокладку столика, зверху накривають кришкою столика і закріплюють її притискними гвинтами (рис. 16Б). Гвинти закручують водночас і досить щільно.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис . 16 Заливний столик : А - в розібраному вигляді , Б - камера , закріплена в столику

 

 

 

Другий етап . Приготування і заливка гелів.

 

Заливку гелів роблять так само , як і в Лабораторній роботі № 1 , при цьому не потрібно заклеювання стекол скотчем і створення агарозній пробки ( рис. 17 ) . Спочатку заливають розділяє гель , чекають його застигання , потім між стекол поміщають гребінку і заливають концентрує гель.

Для приготування 15 % розділяє гелю (для створення однієї пластини потрібно 10 мл ) змішують :

4,5 мл розчину АБ , 2,5 мл трис - HCl буфера , рН 8.8 , 3 мл води ,