Метод електрофорезу в дослідженні біологічних об’єктів

      

       НАЦІОНАЛЬНИЙ АВІАЦІЙНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІНСТИТУТ ЕКОЛОГІЧНОЇ БЕЗПЕКИ

КАФЕДРА БІОТЕХНОЛОГІЇ

 

 

 

 

КУРСОВА РОБОТА

(ПОЯСНЮВАЛЬНА  ЗАПИСКА)

з дисципліни

" Біохімія"

на тему:

"Метод електрофорезу в дослідженні біологічних об’єктів"

 

 

 

Виконала:   студентка ІЕБ 203 групи, Саввич В. Т.

Перевірив:  Васильченко О.А.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Київ 2014

 

НАЦІОНАЛЬНИЙ АВІАЦІЙНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІНСТИТУТ ЕКОЛОГІЧНОЇ БЕЗПЕКИ

Кафедра  Біотехнології

Дисципліна Біохімія

Спеціальність  Біотехнологія

Курс            ІІ                 Група     203                      Семестр             IV 

ЗАВДАННЯ

на курсову роботу студента

Саввич Вікторії Тарасівни

1. Тема роботи: Метод електрофорезу в дослідженні біологічних об’єктів

2. Строк здачі  студентом закінченої роботи    19 травня 2014 року

3. Зміст пояснювальної записки: 1.Класифікація методів хроматографічного аналізу; 1.1. За агрегатним станом рухомої фази; 1.2.За механізмом розділення; 1.3. За способом введення проби; 1.4. Теоретичні засади хроматографії; 2. Види хроматографії; 2.1. Газова хроматографія; 2.2.Рідинна хроматографія; 3.Вузька класифікація видів хроматографії; 3.1.Йоннообмінна хроматографія; 3.2.Гель-проникна хроматографія; 3.3.Плоскошарова хроматографія; 3.4.Хромато-мас-спектрометрія;

  3.4. Конструктивно-технологічні елементи хроматографії; 3.4. Алгоритми хроматографічного аналізу.

 

 

4. Дата видачі завдання       17 березня 2014 р.

 

Студент

Керівник                                                              Васильченко О.А.

«    »                                        2014 р.

 

РЕФЕРАТ

Пояснювальна записка до курсової роботи

" Метод електрофорезу в дослідженні біологічних об’єктів ": 39 с., 13 рисунків; 9 літературних джерел.

ЕЛЕКТРОФОРЕЗ, СОРБЦІЯ, СОРБЕНТ, РУХОМА ТА НЕРУХОМА ФАЗИ, ЕЛЮЕНТ, МЕТОДИ, МІКРОПРОЦЕСОРНА ТЕХНІКА, АНАЛІЗ, ТЕОРЕТИЧНА ТАРІЛКА.

Об’єкт дослідження – процеси розділення та аналізу суміші речовин.

 Предмет дослідження – вивчення методів електрофорезу за різними ознаками класифікації для дослідження біологічних об’єктів.

Мета роботи - дослідження методів електрофорезу, які ґрунтуються на сорбційних процесах.

Методи досліджень - мікробіологічні, статистичні, графічні методи; методи комп’ютерного моделювання та програмування, біохімічні.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Зміст

                                                                                                                 Стр.                           

ВСТУП.......................................................................................................	5
РОЗДІЛ 1. ЗАГАЛЬНІ ВІДОМОСТІ ПРО МЕТОД ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ..........................................................................	6
1.1. Принцип методу електрофорезу білків та електрофоретична     рухливість	7
1.2. Класифікація методів електрофорезу ..........................        1.3. Практичне значення електрофорезу в біології …………….
РОЗДІЛ 2.  ВИКОРИСТАННЯ  РІЗНИХ  ВИДІВ  ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ ПРИ ДОСЛІДЖЕННІ БІОЛОГІЧНИХ ОБ’ЄКТІВ	12
2.1. Особливості електрофорезу в поліакриламідному гелі..................................................................	12
2.2. Нативний і SDS- ПААГ - електрофорез ………………………………………..	17
РОЗДІЛ 3. ПРАКТИЧНЕ ВИКОРИСТАННЯ  ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ …	22
3.1. Проведення нативного вертикального диск- електрофорезу в пластині ПААГ з використанням приладу Стадіера…………………………………..        3.2. Проведення нативного вертикального диск- електрофорезу в пластині ПААГ з використанням камери VE- 10   ………………………………...                 3.3. Плоскошарова хроматографія…………………………………        3.4. Хромато-мас-спектрометрія…………………………………..        3.5. Конструктивно-технологічні елементи хроматографії………        3.6. Алгоритми хроматографічного аналізу……………………….	22 24 25 27 29 35
Висновки…..........................................................................................	38
Список використаної  літератури.........................................	39

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВСТУП

Метод електрофорезу , запропонований ще на початку ХХ століття , зараз широко використовують в біології та медицині для розділення білків в дослідницьких і клінічних цілях. За допомогою електрофорезу можна розділити на окремі компоненти білкову суміш , що дозволяє встановити молекулярну масу білка або його субодиниць , підтвердити чистоту виділеного білка.

Електрофорезом називають рух заряджених частинок в розчині під дією електричного поля.

Електрофоретичний метод в біохімії - це спосіб просторового поділу молекул , що мають різний заряд і розміри , шляхом переміщення їх в електричне поле .

Результатом проведення електрофорезу є електрофореграма - картина , отримана після поділу складної суміші за допомогою електрофорезу і специфічного прояви . Електрофореграма білків біологічних рідин людини (сироватка крові , сеча , спинномозкова рідина та ін.) дозволяє лікарям отримати значну діагностичну інформацію.Наприклад , у здорової людини відносний вміст білкових фракцій при визначенні їх у сироватці крові методом електрофорезу на папері , наступне:

альбуміни - 55-65 % ,

α1 - глобуліни 3-6% ,

α2 - глобуліни 7-10% ,

β - глобуліни - 7-12 % ,

γ - глобуліни - 13-19 %.

При багатьох захворюваннях спостерігається зміна співвідношення фракцій , тоді як загальна кількість білка зазвичай мало змінюється . Виявлення цих змін за допомогою методу електрофорезу широко використовується в діагностичних цілях.

Електрофореграми білків - ферментів ( зімограмми ) дозволяють вивчати зміни активності та ізоферментного спектра таких білків під дією зовнішніх і внутрішніх факторів як у людини , так і в інших організмів . Отримувані дані використовуються в медицині , біотехнології , різних галузях сільського господарства та харчової промисловості.

Метою роботи стало дослідження методів хроматографії, які ґрунтуються на сорбційних процесах.

 Об’єкт дослідження – процеси розділення та аналізу суміші речовин.

 Предмет дослідження – вивчення методів роздільної хроматографії за різними ознаками класифікації.

Методи досліджень. Мікробіологічні, статистичні, графічні методи; методи комп’ютерного моделювання та програмування.

 

РОЗДІЛ 1. Загальні відомості про метод електрофорезу

 

1.1. Принцип методу електрофорезу білків та електрофоретична рухливість

 

У розчині білки знаходяться у вигляді заряджених частинок. Заряд на поверхні білків виникає в результаті дисоціації угруповань , що знаходяться в бічних радикалах амінокислот ( карбоксильних , аміно- , імідазольних та ін груп ) , а також при зв'язуванні іонів. Так як ступінь дисоціації угруповань залежить від рН розчину , то величина і знак сумарного заряду білкової молекули залежать від рН середовища , а також від іонної сили ( інтенсивності електричного поля , створюваного іонами в розчині). Для розрахунку іонної сили слід знайти твір концентрації кожного іона на квадрат його заряду , скласти всі отримані величини і підсумкову суму розділити навпіл. Якщо в розчині присутні два або більше електролітів , то обчислюється загальна сумарна іонна сила розчину.

Для кожного білка існує таке значення рН середовища ( що позначається як Рi - ізоелектрична точка ) , при якому позитивні і негативні заряди іонізованих груп скомпенсовані , тому заряд всій білкової молекули дорівнює нулю. У буфері з рН , рівним Рi досліджуваного білка , відсутність заряду на білковій молекулі унеможливлює її рух в електричному полі. Через різницю в аминокислотном складі

різні білки мають різні значення Рi .

При рН ≠ pI молекули білка набувають заряд і під дією електричного поля переміщуються до протилежно зарядженого електроду

- Катода (-) або анода (+). Наприклад , кислі білки , багаті моноамінодікарбоновимі  амінокислотами ( асп , гли ) , в слабощелочном  буфері придбають негативний сумарний заряд через дисоціації СООН - груп до СОО - і H + і будуть рухатися до анода. Для електрофоретичного розділення оптимально таке значення рН робочого буфера , яке обумовлює максимальне розходження зарядів різних білків, що складають вихідну суміш , а не їх максимальний заряд. Зазвичай електрофорез проводять в середовищі ( буфері) зі значенням рН , на 3 - 4 одиниці відрізняється від середнього значення Рi для білків даного типу. Це дозволяє домогтися гарної електрофоретичної рухливості (див. нижче ) і разом з тим - зберегти

відчутні відмінності молекул по заряду . Переважно використовувати буфер відомою і постійною іонної сили на основі однозарядних іонів. Від робочого буфера також потрібна істотна ємність , так як локальна концентрація білка в утворюються при поділі суміші зонах скупчення молекул може виявитися значною. Тому використовують буфери з концентрацією не менше              0,1 - 0,2 М. 

При проведенні електрофорезу електричне поле створюють за допомогою джерела живлення - стабілізованого випрямляча , здатного давати регульоване напругу до 500 - 1000 В при силі струму в декілька десятків міліампер ( мА). Переважно використовувати випрямляч зі стабілізацією по струму.

Грамотне застосування електрофоретичного методу передбачає оперування фізичними величинами , що вказані нижче.

φ - потенціал , В ( вольт). Потенціал в даній точці електричного поля чисельно дорівнює роботі, яку здійснюють електричними силами при переміщенні одиничного позитивного заряду з цієї точки в нескінченність.

U - напруга , В ( вольт). Напруга  на ділянці електричного кола  дорівнює різниці потенціалів  на кінцях цієї ділянки , якщо  на цій ділянці немає джерела  сторонніх сил , які поділяють  різнойменні заряди (відсутні гальванічні  елементи , фотоелементи , генератори магнітного поля і т.д.). При електрофорезі ділянку електричного кола - це буфер. У буфері відсутні джерела сторонніх сил , тому

U = φ1 - φ2 = Δ φ . рівняння 1

За законом Ома:

U = I * R , Рівняння 2

де I - сила струму , R - опір провідника ( буферного розчину).

Е - напруженість електричного поля , В / см .

E = Δφ / L = U / L , Рівняння 3

де L - довжина провідника в см.

Електрофорез проводять в однородному електричному полі , тобто поле ,

напруженість E якого в усіх точках однакова.

Електричний струм пропускають через провідник - буферний розчин , налитий у канал з ізолюючого матеріалу (наприклад , скла) або

просочуючий -яку підтримуючу середу - носій (наприклад , папір або гель). Опір R буферного розчину задається двома факторами: концентрацією в ньому вільних іонів і їх електрофоретичної рухливістю.

Електрофоретичної рухливістю ( u ) даної молекули називають швидкість руху зарядженої молекули ( яка виражається в см / ч) в електричному полі з напруженістю 1 В / см . Одиницею електрофоретичної рухливості є             см2 / год ∙ В або , спрощено , см / ч. 

Саме відмінності в електрофоретичної рухливості білків, що містяться в аналізованої суміші , роблять можливим розділити ці білки в просторі ( в різних зонах електрофореграми ) .

Швидкість V руху білків до того чи іншого електроду знижується з - за їх тертя об навколишнє середовище. Сила тертя ( або , інакше , опору навколишнього середовища ) прямо пропорційна швидкості руху білкових молекул:

Fтертя =f ´ V 

 

Коефіцієнт тертя білкової молекули , позначений як f , залежить як від розміру , форми і ступеня гідратірованіем цієї молекули , так і від властивостей самого середовища .

Електрофоретична рухливість пов'язана з коефіцієнтом тертя у відповідності з рівнянням :

и = q

      f

 

де q - загальний заряд молекули білка ,

f - коефіцієнт тертя.

 

 

При електрофорезі робота сили тертя заряджених компонентів суміші, про середовище призводить до нагрівання гелю. Крім того , утворення тепла викликається проходженням електричного струму. У результаті відбувається значне зростання температури , яке погіршує результати електрофоретичного розділення , так як змінює в'язкість і провідність середовища , збільшує швидкість дифузії молекул , сприяє випаровуванню летких компонентів , призводить до денатурації білків. Тому при проведенні електрофорезу слід забезпечити охолодження системи (наприклад , поміщаючи прилад для електрофорезу в холодильну камеру).

Електрофоретична рухливість білка залежить :

- Від самої молекули : її розміру ( молекулярної маси) , форми , електричного заряду , ступеня  дисоціації і гідратації ,

- Від концентрації молекул ,

- Від середовища: її в'язкості , рН , температури і іонної сили ,

- Від характеристик використовуваного  електричного поля.

 

1.2. Класифікація  методів електрофорезу