Метод електрофорезу в дослідженні біологічних об’єктів

Основними типами електрофорезу є:

- Зональний електрофорез,

- Ізотахофорез,

- Ізоелектричного фокусування,  

- Іммуноелектрофорез.

Зональний електрофорез ведеться при постійному (не змінюється) значенні рН буферного розчину, що заповнює цей носій (папір, гель, ін.) Досліджуваний зразок наноситься плямою або тонким шаром на носій, по

якому і переміщається в електричному полі. Ускладненим варіантом зонального електрофорезу є диск-електрофорез (багатофазний зональний електрофорез), при якому рН та інші характеристики, постійні всередині однієї "фази", при переході до іншої "фазі" стрибкоподібно змінюються.

При ізоелектричному фокусуванні в середовищі для електрофорезу створюється плавний градієнт рН. Білок зупиняється в зоні, де значення рН одно його ізоелектричної точці (pI). Для створення градієнта рН зазвичай використовують розчин ПОЛІАМІНИ-полікарбонових кислот, яким насичують носій. У відсутності електричного поля ця суміш зазвичай має рН = 6,5. При накладенні електричного поля зазначені кислоти забезпечують лінійний градієнт рН від 3 до 10.

У разі ізотахофореза заряджені іони спочатку розділяються в

Відповідно до величинами їх заряду і рухливості, а потім переміщаються в електричному полі з однаковими і постійними швидкостями.

Іммуноелектрофорез поєднує в собі електрофоретичної поділ білків з іммунопреціпітаціі, заснованої на реакції "антиген - антитіло". Цей тип електрофорезу перевершує інші по чутливості і роздільної здатності.

По меті розрізняють:

- Аналітичний (для аналізу  складу суміші, рідше - для отримання  малих кількостей поділюваних  речовин) електрофорез,

- Препаративний (для отримання  препаратів - значних кількостей  чистих речовин) електрофорез.

За ступенем денатурації поділюваних білків розрізняють

- Нативний електрофорез,

- Електрофорез в денатуруючих  умовах.

На відміну від нативного електрофорезу, електрофорез в денатуруючих умовах передбачає застосування хімічних реагентів, що руйнують просторову структуру поділюваних білків.

У напрямку фракціонування виділяють електрофорез, при якому білки рухаються в одному напрямку, і двовимірний електрофорез, при якому спочатку проводять поділ в одному напрямку, а потім - у напрямку, перпендикулярному першому. Двовимірний електрофорез дозволяє різко збільшити роздільну здатність при поділі сумішей, що складаються з великої кількості різних білків.

Залежно від орієнтації носія (гелю, паперу, ін) електрофорез може бути вертикальним або горизонтальним.

Класифікація за типом носія рідкої фази представлена ​​в таблиці 1. Вона також відображає розвиток електрофоретичних методів у  

історичному аспекті. Першим був розроблений електрофорез без будь-якого носія: електричний ланцюг між електродами замикалася через буферний розчин, в якому і відбувалося розділення білків. Пізніше при електрофорезі почали застосовувати носії рідкої фази - полімери, службовці "каркасом" для буфера. Застосування носіїв дозволило помітно знизити конвекцію (перемішування) і, отже, підвищити якість розділення білків. Носій може бути у формі порошку, плівки, гелю та ін Наступні розробки були присвячені удосконаленню властивостей носіїв.

Ідеальний носій повинен:

а) різко знижувати конвекцію;

б) бути простим у приготуванні;

в) мати високу теплопровідність (при низькій теплопровідності важко охолоджувати систему);

г) володіти низькою адсорбційною ємністю і хімічної інертністю щодо речовин, що піддаються електрофорезу;

д) не мати заряду на поверхні частинок, щоб не викликати

ендоелектроосмос. Якщо розділяються білки заряджені негативно, то при електрофорезі вони повинні рухатися до анода (+), однак ендоелектроосмос "тягне" їх в іншу сторону, до катода (-), заважаючи електрофоретичного розділення.

Гелі легко приймають різні геометричні форми, тому в назві електрофоретичного методу з їх використанням вказують, яка конфігурація робочого простору. Гель для електрофорезу можна заполімерізовать:

- В трубках,

- В капілярах,

- В пластинах ("слябів" - від англ. Slab),

Основний недолік електрофорезу в трубках - це відсутність теплооттока: температура в центрі циліндра гелю виявляється вище, ніж у його

прилеглої до скла поверхні. Це призводить до вигину білкових зон. На

одну трубку наноситься одна досліджувана проба.

Підвищити теплоотток можна, застосовуючи дуже тонкі трубки - капіляри. У тонких пластинах також досягається набагато більш ефективне відведення тепла, ніж у трубках. Так, при повітряному охолодженні ефективний тепловідвід можливий при силі струму 50 - 100 мА на вертикально розташовану пластину (тобто розсіює у вигляді тепла потужність не перевищує 20 Вт). Крім того, конфігурація пластини дозволяє в абсолютно ідентичних умовах проводити поділ відразу декількох (10 - 13) проб білка. Пластини легко сканувати і зручно розрізати. У порівнянні з циліндричними гелями гелеві пластини дозволяють значно зменшити концентрацію білка в наносимой пробі.

 

 

 

 

 

 

 

 

РОЗДІЛ 2. ВИКОРИСТАННЯ  РІЗНИХ  ВИДІВ  ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ ПРИ ДОСЛІДЖЕННІ  БІОЛОГІЧНИХ ОБ’ЄКТІВ

 

2.1. Особливості  електрофорезу в поліакриламідному  гелі

 

Поліакриламідний гель ( ПААГ ) володіє багатьма якостями ідеального носія. Маючи властивості молекулярного сита , він забезпечує електрофоретичної поділ білкових сумішей не тільки по заряду , а й за розміром і формою частинок. При електрофорезі в ПААГ великі молекули , розміри яких порівнянні з діаметром пір гелю , рухаються повільніше , а дрібні молекули вільно і швидко проходять через пори гелю.

ПААГ формують шляхом кополімеризації акриламіду ( що створює лінійну "основу" ) і N , N'- метіленбісакріламіда ( службовця для

поперечних " зшивок " лінійних ланцюгів) .

 

СН2 = СН- СО- NН2 СН2 = СН- СО- NН - СН2- NН -СО - СН = СН2

Акріламід N , N ' – метіленбісакріламід

 

Міняючи концентрацію акриламіду від 2 до 50 % можна задати певну пористість гелю. Наприклад , діаметр пір в гелі , що містить 7,5 % акриламіду, дорівнює 5 нм , а 30 % акриламіду - 2 нм. При виборі концентрації гелю враховують середню молекулярну масу ( Mr ) поділюваних речовин і форму їх молекул (див. табл. 2 ) .

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Вибір концентрації акриламіду при різному діапазоні молекулярних мас досліджуваних білків

 

Розмір білка, кДа	Концентрація акриламіда, %
36 - 205	5
24 - 205	7,5
14 - 205	10
14 - 66	12,5
10 - 45	15

Таблиця 2

В результаті сополимеризации утворюється тривимірна сітка гелю , будова фрагмента якої представлено на рис. 1 . Кожен другий вуглецевий атом лінійного ланцюга містить кислотну амидную групу , що забезпечує гідрофільність полімеру. Водночас ПААГ не містить іонізіруемих груп . 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис . 1 Структура поліакріламідного гелю

Для сополимеризации потрібні ініціатори та каталізатори ( окислювально- відновні системи - джерела вільних радикалів ) . Найчастіше використовують систему з двох компонентів , представлених нижче:

 

             (NH4)2S2O8                                         (CH3)2N-CH2-CH2-N(CH3)2

Персульфат амонію (ПСА ) .                 N , N , N ' , N'- тетраметілетілендіамін

Синонім - надсірчанокислий амоній         ( ТЕМЕД )

Функція : ініціатор полімеризації           Функція : каталізатор освіти ПААГ

 

Механізм дії персульфата ілюструє рис. 2 : при розриві зв'язку О -О утворюються два вільних радикала , кожен з яких стимулює розрив подвійного зв'язку в молекулі акриламіду і приєднується до неї , також утворюючи вільні радикали. Кожен такий радикал , у свою чергу , викликає розрив подвійного зв'язку і приєднання наступній молекули акриламіду з утворенням нового радикала , і т. д. Ланцюгова реакція полімеризації йде до тих пір , поки два радикала , зустрівшись між собою , не утворюють звичайну ковалентний зв'язок . За таким же механізмом в зростаючу ланцюжок лінійного полімеру одній зі своїх кінцевих вінільних груп може вбудуватися метіленбісакріламід . Якщо його другий кінець вбудується до складу іншої лінійної полімерної ланцюжка , то утворюється « зшивання » (показана на рис.1). Без агента , що утворює поперечні зшивання , в гелі утворюються лише поздовжньо розташовані довгі тонкі волокна.

Рис . 2 Механізм дії персульфата амонію як ініціатора полімеризації акриламіду

а ) Персульфат амонію поступово розкладається , у водних розчинах - вельми швидко. При розчиненні персульфат виробляє характерне поклацування . Якщо 1 %-ний розчин персульфата у воді має рН < 2 , або прирастворениинеслышнощелчков , топерсульфатнепрігоден .

б) Персульфат здатний окисляти речовини, що розділяються , що може призвести до появи додаткових смуг або інактивації ферментів.

Тому перед досвідом рекомендується провести електрофорез без нанесення проби з метою видалення зайвого персульфата .

 

 

2.2. Нативний і SDS- ПААГ - електрофорез

 

 

У поліакриламідному гелі можна проводити як нативний електрофорез, так і електрофорез вденатурірующіхусловіях .

Нативний електрофорез в ПААГ служить для розділення не підданих денатурації білків ( тобто білків в нативному стані) , в тому числі - у випадках , коли необхідно зберегти ферментативну або будь-яку іншу функціональну активність білків. Електрофоретична рухливість білка в нативному стані залежить одночасно і від його сумарного заряду , і від молекулярної маси , і від просторової конфігурації поліпептидного ланцюга. Для встановлення суворої кількісної кореляції між одним з цих параметрів і електрофоретичної рухливістю білка потрібно виключити вплив всіх інших.

У випадку, коли потрібно Фракціоновані білки виключно за молекулярною масою , застосовують ПААГ - електрофорез в денатуруючих

умовах. Така система була розроблена У. К. Леммлі . Цей метод дозволяє 

оцінити кількість поліпептидів в білкової суміші , їм досягається дуже чіткий поділ зон , але активність ферментів повністю або значною мірою може бути втрачена через їх денатурації . Денатурирующие умови досягаються шляхом обробки проби триразовим надлишком додецилсульфата натрію (синонім - лаурилсульфат натрію) , скорочено - ДСН (рис. 3 ) . Найчастіше дана речовина позначають SDS - від англійського " sodium dodecyl sulfate " . Анион SDS несе негативний заряд.

 

 

 

                                                                             М.м. = 288,4

Рис . 3 додецилсульфат натрію ( ДСН , SDS )

 

Завдяки гідрофобним взаємодіям аніони SDS сорбируются на білках пропорційно їх обсягом , перетворюючи будь поліпептид в нерозгалужений стрижень з негативним зарядом , що значно перевищують власний заряд білкової молекули. З більшістю білків SDS зв'язується приблизно однаково - у співвідношенні 1,4 мг SDS на 1мг білка. Так як в присутності SDS співвідношення " розмір / заряд " стає практично однаковим для будь-якого білка , розподіл відбувається виключно за молекулярною масою .

Відзначимо , що для повної денатурації білки, що мають SS- зв'язку , до застосування SDS обробляють β - меркаптоетанолом , які мають сильний неприємний запах , тому роботи проводять під тягою. Як альтернатива β - меркаптоетанол використовують дітіотреїтолу ( С4Н10О2S2 , Mr = 154,25 ), його потрібно в 2 рази менше , він менш летючий і не має настільки специфічним запахом , проте , він набагато дорожче.

 

2.3. Диск- електрофорез

 

Диск- електрофорез отримав свою назву від двох англійських слів: discontinuity ( неоднорідний , переривчастий) і discoid ( дискообразний ) . Перше підкреслює неоднорідність електрофоретичної середовища , застосовуваної в цьому методі . Друге описує випадковий ознака - дискообразную форму зон розділених білків в умовах , обраних першовідкривачами методу . При диск- електрофорезі створюють стрибкоподібні зміни концентрації (і, отже , пористості ) гелю , рН , градієнта напруги.

Вертикальний диск- електрофорез припускає використання двох , а іноді й трьох нашаровуються один на одного гелевих шару : 

 

1 ) Стартовий гель ( sample - гель) - присутній не завжди. Він розташовується  зверху , містить пробу і барвник - "свідок " , який показуватиме рух електрофоретичного фронту. Стартовий гель запобігає змішування розчину проби з електродним буфером .

2 ) концентруйте гель - великопористий  гель. Розмір його пір обмежує  дифузію , але не забезпечує гелю  властивості молекулярного сита по відношенню до поділюваних білкам . Цей гель потрібен для електрохімічного концентрування білків проби , тобто концентрує гель збирає суміш білків перед переходом в розділяє гель в одну вузьку смугу.

3 ) Розділяючий ( сепаруючий , дозволяючий, " running " - гель) - нижній мілкопористий гель , в якому, власне , і відбувається електрофоретичної і молекулярно- ситові поділ компонентів проби .

Диск- електрофорез проводиться в комбінованій системі буферів - з відмінними значеннями рН і різного компонентного складу в електродних частинах верхнього і нижнього гелю ( рис. 4 ) .

 

 

Рис . 4 Переривчаста система буферів ( трис - трис ( гідроксиметил ) амінометан , ( СН2ОН ) 3 - NН2 )

 

Наявність переривчастою системи буферів збільшує роздільну здатність методу через що виникає електрохімічного ефекту , що забезпечує концентрування компонентів проби і освіту тонкої стартовою зони на кордоні концентрирующего і розділяє гелів.

Буферні суміші підбирають так , щоб електрофоретичної рухливість іонів в одній з них була вище , ніж в іншій. Наприклад , в електрофоретичної системі , зображеній на рис. 4 , електродний буфер з рН 8,3 володіє більш повільними іонами гліцинат , а буфер концентрирующего гелю - більш швидкими хлорид - іонами . Під дією електричного поля «швидкі» хлорид - іони спрямовуються у бік анода ( +) , залишаючи за собою бідне іонами простір , внаслідок чого спостерігається різке падіння напруги. У результаті виниклого перепаду напруги в цьому просторі , «повільний» іон гліцинат починає прискорюватися , наздоганяє «швидкий» хлорид - іон і надалі рухається з тією ж швидкістю , що і швидкий .