Плазмиды

Механизмами, ограничивающими  перенос, являются поверхностное исключение, которое снижает вероятность  переноса 100-300 раз и детерминируется  плазмидными генами traS traT и неэффективность  пилей. Кроме того, существуют ограничения, действующие после проникновения  плазмид в клетки, так в результате изменения экспрессии плазмидных генов, клетки иногда не получают донорских  свойств, плазмиды могут разрушаться  рестриктазами, кодируемыми внутриклеточ-ным  генетическим материалом (предполагают, что конъюгативные хромосомы  с широким диапазоном переноса обладают генами с антирестрикционными функциями. Важными механизмом является летальный  зигозис.

Свойства бактерий, контролируемые плазмидами.

Плазмиды лекарственной  резистентности.

Общая характеристика и механизмы  действия.

По данным японских исследователей, первый случай выделения бактерий, устойчивых к нескольким лекарственным  веществам с различными механизмами  действия, был отмечен в 1955 г. в  клинике при обследовании женщины, больной дизентерией. От нее была выделена шигелла, устойчивая к действию сульфамидов, стрептомицина, хлорамфеникола и тетрациклина. Вскоре после этого  в 1956 г. было выделено большое количество дизентерийных штаммов, обладавших резистентностью к тем же четырем  лекарственным веществам, причем во многих случаях лечение проводилось  лишь одним из них. Вслед за японскими  работами появились сообщения о  множественной резистентности, выявленной у других представителей семейства  энтеробактерий и стафилококков. Японские ученые доказали возможность передачи всего комплекса устойчивости от его носителей к чувствительным бактериям. Для обозначения комплекса  генетических детерминантов множественной  лекарственной устойчивости японские исследователи предложили символ R.

R-плазмиды детерминируют  резистентность бактерий к лекарственным  веществам – главным образом  антибио-тикам и сульфаниламидам.  В широком плане к плазмидам  резистентности относят плазмиды, кодирующие резистентность бактерий  к бактериофагам, бактерио-цинам,  сыворотке, ионизирующему излучению,  тяжелым металлам и др. Наиболее  полно изучены R-плазмиды грамотрицательных  бактерий. Большинство из них  конъюгативные, а R-плазмиды грамположительных  – неконъюгативные.

Большинство генов устойчивости транспозонного происхождения. Их отличительная  особенность в том, что они  включаются в определенных местах. Такие последовательности именуются  интегронами, а их носителями являются обычно транспозоны.

ДНК R-плазмид представлена в виде ковалентно закрытых кольцевых  молекул, предположительно в суперспирализированной форме.

Молекулярная масса, копийность

И другие свойства некоторых R-плазмид.

Плазмида	Молек. масса	Организм	Копийность
R1	65	E. coli	1
R6	65	E. coli	1
R6K	26	P. mirabilis	13 — 38
R100	75	P. mirabilis	13 — 38
RR4	40	P. mirabilis	1 – 3
SuSm	5 — 6	E. coli	5,8 — 8
PSC101	5,6	E. coli	6
RSF1030	8,3	E. coli	6
RSF2124	7,4	E. coli	10

Резистентность бактерий, содержащих R-плазмиды, обычно зависит, от вида бактерий и типа антибиотиков. Например, клетки E. coli в большинстве  устойчивы к стрептомицину при  его концентрации в среде 10 — 25 мкг/мл, тогда как шигеллы – при  концентрации 10000 мкг/мл, сальмонеллы  резистентны к тетрациклину при  концентрации 10 мкг/мл, тогда как  шигеллы – при концентрации 100 – 250 мкг/мл.

Для плазмидных детерминантов  резистентности часто характерно повышенная экспрессивность. Повышение копийности плазмид в результате мутаций  генов репликации сопровождается значительным повышением уровня резистентности и  подчиняется закономерности «доза-эффект». Повышении экспрессии плазмидных детерминантов  лекарственной устойчивости может  происходить также и посредством  других механизмов: амплификация, приобретение множественных копий транспозонов, повышение интенсивности транскрипции генов.

При смешанном культивировании  бактерий различной видовой принадлежности возможен межродовой перенос некоторых  плазмид. Например, S. typhimurium ® V. cholerae, S. marcescens ® Y. pestis, P. aeruginosa ® E. coli.

В результате систематического мониторинга лекарственной резистентности кишечных бактерий разных видов, предпринятого  в 60-х гг. в Японии, были получены результаты, свидетельствующие, что  клетки

~ 58% штаммов, устойчивых  к тетрациклину, канамицину, стрептомицину,  сульфаниламидам, содержат плазмиды. Исследования последних лет свидетельствуют  о том, что и конъюгативные  и неконъюгативные R-плазмиды, детерминирующие  резистентность к антибиоти-кам  и сульфаниламидам, присутствуют  в бактериях многих видов, в  разных зонах мира.

Лекарственная резистентность энтеропатогенных штаммов E. coli, выделенных в Англии в 1980-81 гг.

Лекарственные вещества	Концентрация мд/л	К-во резистентных штаммов (%)
Пенициллин	8	37,1
Хлорамфеникол	8	12,5
Фурозолидол	20	0,4
Гентамицин	4	0
Налидиксовая к-та	20	0
Неомицин	8	9,1
Стрептомицин	16	45,7
Сульфонамиды	100	45,7
Тетрациклин	0,5	6

Всего 232 штамма, из них 134 –  с резистентностью, а 65 – с трансферрабельной  резистентностью.

Исследование 24 энтеропатогенных штамма E. coli, выделенных от больных  людей и домашних животных в 70-е  гг. в СССР показало, что 16 из них  являются резистентными к 1 или более  антибиотиков, чаще всего к стрептомицину, тетрациклину, канамицину. В клетках 9 штаммов были конъюгативные плазмиды.

Возрастание частоты резистентности и встречаемости в резистентных штаммах R-плазмид происходит по мере использования антибиотиков и др.

Значительный рост резистентности, обусловленный плазмидами, отмечается у стрептококков, причем частота  зависит от антибиотика. Например, большинство  выделенных в Японии S. pyogenes резистентны  к 1 — 2 антибиотикам, более 50% штаммов  резистентны одновременно к тетрациклину, эритромицину и хлорамфениколу. Резистентность к тетрациклину особенно часто встречается среди стрептококков этого вида, групп B, D. Для многих штаммов S. pneumonie показана множественная лекарственная резистентность.

Возрастание частоты резистентности четко видно на стафилококках (S. aureus) – частых возбудителей внутригоспитальных инфекций.

После открытия пенициллина, период эффективной пенициллинотерапии был очень коротким, т. к. уже к 1946 г. госпитальные штаммы были на 50% резистентны  к нему. В начале 60-х гг. были введены  в практику метециллин и оксациллин, бывшие достаточно эффективными до конца 60-х гг.

Начиная с 50-х гг., начиная  с США, стали выделять штаммы одновременно резистентные и к пенициллину, и  к стрептомицину, хлорамфениколу и  эритромицину. Неомицин-резистентные штаммы стафилококков появились  в 1959-60 гг., а через 10 лет развилась  резистентность к родственным антибиотикам: канамицину и парамицину. В 1976 г. были зарегистрированы внутригоспитальные вспышки, вызванные стафилококками, резистентными и к гентамицину  и др. аминогликозидам. В этом же году появились сообщения о выделении  стафилококков, резистентных и к  гентамицину и метициллину, но и  к пенициллину и стрептомицину, выделенных в Мельбурне, Лондоне, Дублине  и США.

Как выяснилось, плазмиды могут  участвовать в формировании хромосомной  резистентности в качестве векторов транспозируемых генетических элементов.

Частота, с которой появляются резистентные бактерии в среде очень  высока. Поскольку лекарственные  вещества и кормовые антибиотики  используются в ветеринарии и  растениеводстве, то распространение  селекционированных резистентных организмов от одного к другому хозяину, а  так же от животных к человеку имеет  важное эпизоотическое и эпидемиологическое значение.

Механизмы лекарственной  резистентности.

Лекарствен-ное в-во	Мишень	Механизм ре-зистентности	Продукт плазмиды
Пенициллин	Клеточная стенка; Ингибирует ферменты, отвечающие за синтез клет. стенки	1.Ферментатив-ная  инактива-ция.2.Снижение количества  или родства пенициллина.3.Толерантность  к бактерицид-ным эффектам антибиотиков	B-лактамаза
Хлорамфени-кол	Рибосома. Ингибирование  синтеза транспептидазы	1.Инактивирова-ние  антибиотика ацетилирование его  OH групп.2.Изменения в транспорте  антибиотиков	Ацетилтранс-фераза.
Макролиды(эритромицин, олеандомицин) и линкозамиды(линкомицинКлиндамицин  стрептограмин B)	Рибосома. Ингибирование  синтеза белка	Изменение рибосомыN6 – диметил-лирование аденинового  остатка в pPHK)	Метилаза
Сульфонамиды	Конкурентное ингибирование  дигидро-птероатсин-тетаза	1.Замещение фермента  чувствительного к сульфонамиду2.ИзмененияВ  транспорте	Дигидроптеро-атсинтетаза, резистентная к сульфонамиду
Триметоприм	Конкурентное ингибирование  дигидрофолат-редуктазы.	Сверхпродукция  дигидрофолат-редуктазы.	Дигидрофолат-редуктаза  резистентная к триметоприму.
Тетрациклин	Рибосома. Ингибирование синтеза белков.	Изменения в транспортеАнтибиотикаEfflux-механизм.	ИндуцибельныеTet-белки.
Аминоглико-зиды:
Стрептомицин	Рибосома. ИнгибируетСинтез белковМембраны.	Изменения вСтруктуреРибосом.Модификация  антибиотикаФерментами.	Аминоглико-Зидфосфа-трансферазаАктивный  ацетил.
Спектиномицин	-//-	Изменения в транспорте антибиотика	N-ацетилтранс-феразаO-фосфотранс-феразаO-нуклеотид-Трансфераза.
Неомицин, канамицин,Гентамицин и др.	-//-	-//-	O-аденилтранс-фераза.Ацетилтранс-Фераза.
Фузидовая кислота.	Ингибирование фактора  элон-гации в бел-ковом синте  — зе на уровне рибосомы.	Непроницаемость клетки для антибиотиков.	Ацетилтранс-фераза.

Ферментативная инактивация  антибиотика происходит в среде  за пределами клетки. Одиночные клетки поэтому беззащитны. Ферменты b-лактамазы  инактивируют

B-лактамные антибиотики  путем гидролиза еще до того, как они успеют проникнуть  через клеточную мембрану и  достичь пенициллинсвязывающих  белков в ЦПМ.

Изменение сайтов-мишеней  в качестве механизма резистентности показаны с случае многих антибиотиков. Однако прямое отношение доказано лишь в случае эритромицина и линкомицина. Механизмы резистентности к этим антибиотикам заключаются в специфическом N6-диметилировании 2-х адениновых остатков в рРНК, в результате чего, такие  рибосомы в значительно меньшей  степени связываются с антибиотиком (такое связывание привело бы к  ингибированию белкового синтеза).

Efflux-механизм характерен  для резистентности к тетрациклинам.  Он связан с удалением из  клетки этого антибиотика. Не  исключено, что пониженное действие  тетрациклина связано как с  пониженным его восприятием клеткой,  так и с efflux-механизмом.

Обходные механизмы лежат  в основе плазмидной резистентности к сульфонамидам и триметоприму. Плазмиды обеспечивают клетки новым  ферментом, заменяющий подавленный  и нечувствительный к ингибирующему  действию антибиотика.

Кроме всего перечисленного плазмиды определяют также и резистентность к тяжелым металлам и др.

Резистентность к ртути  и ртутьорганическим соединениям. Токсичность ионов ртути для  бактериальной клетки определяется тем, что они очень легко связываются  с сульфгидрильными группами мембранных белков и ферментов, ингибируя синтез макромолекул и др. действия ферментов.

Резистентность к кадмию, который, связываясь с сульфгидрильными группами мембранных белков, прекращает клеточное дыхание.

Резистентность к серебру (действует в том же направлении, что и кадмий).

А также ко многим другим веществам (медь, висмут,

Свинец, бор, хром, кобальт, никель, соединения цинка).

Мутации внехромосомных

Факторов резистентности.

Эписомные элементы (плазмиды), обладающие способностью поддерживать собственное автономное состояние  и независимость скорости репликации от регуляторных механизмов клетки-хозяина, также независимо могут мутировать, либо не влияя на поведение бактериальной  клетки, либо в какой-то мере изменяя  ее физиологические функции.

Обычно принято считать, что эписомные детерминанты контролируют невысокую резистентность; однако в  действительности имеется немало наблюдений, противоречащих такому представлению. Наблюдался четко выраженный мутаторный эффект у штамма Salmonella typhi, выделенного  от больного; штамм этот характеризовался наличием разных типов R-факторов: Sin, Тс, только Тс, или Тс, Sm. Культуры бактерий Salmonella typhi, Salmonella typhimurium и E. coli, инфицированные этими факторами, проявляли генетическую нестабильность и мутабельность  детерминантов резистентности к  высоким концентрациям антибиотиков. Высокая резистентность передавалась реципиентам при последующей  конъюгации со скоростью, типичной для  трансмиссивных элементов. Внехромосомная локализация детерминантов, контролирующих высокую резистентность, подтверждалась возможностью их элиминации. Генетический анализ мутаций у полирезистентных штаммов довольно сложен прежде всего  потому, что в них могут сосуществовать независимые друг от друга комплексы  детерминантов резистентности со своими автономными факторами передачи, и каждый такой комплекс может  видоизменяться в результате разнообразных  событий — мутаций, сегрегации или  рекомбинаций. Фенотипическое выражение  подобного рода изменений в состоянии  генома бактериальной клетки часто  взаимно маскируется и с трудом поддается дифференцированному  тестированию.

Часто имеет место мутационное  изменение генов, контролирующих репликацию самого фактора резистентности в  естественных условиях. Такие мутации  могут увеличить копийность плазмиды, что часто усиливает резистентность к большим концентрациям лекарственных  и других веществ.

Иногда в мутациях затрагиваются  регуляторные механизмы, контролирующие проявления конъюгативности бактерий. При этом может, например, сниматься  репрессия донорской активности.

Роль бактериального генома у сальмонелл нередко проявляется  в ограничении функций внехромосомных элементов, в том числе и факторов трансмиссивной устойчивости к лекарственным  веществам. Известно, например, что  сальмонеллы обладают низкой реципиентной активностью. R-факторы воспринимаются ими, как правило, с незначительной частотой, что связывается с ограничением, контролируемым клеткой-хозяином. Под  влиянием мутагенов можно получить мутанты R-факторов, способные преодолевать это ограничение. Такие мутанты  были получены путем воздействия  нитрозогуанидина на Salmonella typhimurium c R-фактором дикого типа; способность R-мутантов преодолевать ограничения представляется функцией, независимой от реципиентных свойств  бактерии-хозяина.

Мутации по устойчивости к  хлорамфениколу наблюдали еще в 1969г. у штамма Klebsiella c устойчивостью  к пяти антибиотикам. При конъюгации маркеры резистентности передавались реципиентам из различных систематических  групп грамотрицательных бактерий — эшерихий, шигелл, протеев и  др., а также путем трансдукции  с фагом Рlс из E. coli. Проявление мутационного эффекта только в отношении  резистентности к одному антибиотику  свидетельствует об индивидуальной генетической реакции отдельных  детерминантов резистентности на воздействие  мутагенов.

Это далеко не исчерпывающее  описание возможных мутаций, котрых у плазмид может наблюдаться  огромное множество.

Элиминация R-факторов.

Лекарственная устойчивость бактерий, детерминируемая трансмиссивными  генетическими элементами, представляет серьезную угрозу ее неограниченного  распространения, принимающего масштабы подлинной «пандемии» в микро  мире, связанной с экологией человека и животных. Поэтому в настоящее  время придается чрезвычайно  важное значение исследованиям, направленным на изыскание путей предотвращения или по крайней мере существенного ограничения распространения лекарственной устойчивости у бактерий, составляющих микрофлору нестерильных полостей макроорганизма — человека, животных, птиц и даже возможных переносчиков бактериальных возбудителей инфекции.

Многими исследователями  было замечено, что признаки устойчивости к лекарственным веществам у  грамположительных и грамотрицательных  бактерий, контролируемые внехромосомными  детерминантами, нередко утрачиваются спонтанно или закономерно исчезают после обработки определенными  соединениями, обладающими избирательной  ДНК-тропностью. Этот феномен, обозначаемый термином «элиминация», связанный с  утратой генетических детерминантов, в том числе плазмид и факторов резистентности, используется как одно из доказательств их внехромосомной локализации.