Плазмиды

Передаваясь от клетки к клетке, плазмиды распространяются «эпидемически» (по выражению Fredericq) в популяции  чувствительных бактерий по типу вирусных агентов. Благодаря этому свойству конъюгативные плазмиды именуются  инфекционными.

Многие плазмиды, обладающие свойством самопередачи (за исключением F), в большинстве клеток донорской  популяции репрессированы. Их активность регулируется системой оператор –  репрессор, в которой соответствующая  группа генов включается периодически в зависимости от накопления в  клетке специфических субстратов, контролирующих их функции.

Генетическая организация

Неконъюгационных плазмид.

Эти плазмиды не содержат RTF, только различные генетические детерминанты (например r) и rep-систему.

К ним относятся такие  плазмиды как, ColE1, pSE101, SuSm и тд. Наиболее изучены ColE1, CloDF13. Для них характерна кластерность генов на генной карте. Например, район, отвечающий за репликацию, включает O-пункт и детерминанты, контролирующие репликацию. К этому  району примыкает отвечающий за колициногенность.

Поддержание в клетках.

Выдающееся свойство плазмид  – поддержание в бактериальных  клетках в определенном числе  копий. Здесь важны процесс репликации и точного распределения между  дочерними клетками. У F-плазмиды имеется  процесс, контролируемы плазмидой  в виде пары генов ccd, определяющий отсеивание клеток, утерявших плазмиду. Заключается  в деструкции клеток, в которых  произошла ее элиминация. Когда клетка теряет плазмиду, происходит активация  продуктов генов ccd, что влечет к  запуску механизма самоубийства в клетке и далее в ее потомках.

Репликация. Базовый репликон.

Репликационный цикл ДНК  плазмид, как и хромо-сомной, состоит  из инициации, элонгации и терминации.

При удвоении ДНК плазмид  образуется ковалентно закрытые, но не сверхскрученные, молекулы, которые  затем конвертируются в молекулы сверхспирализованной ДНК. Процесс  элонгации непрерывен. Для завершения цикла удвоения необходимо, что бы первичная элонгационная вилка  достигла терминуса, а вторая начала движение от O-пункта в противоположном  направлении вплоть до терминуса.

Все, что в настоящее  время известно о репликации плазмид, выяснено, в основном, в ходе изучения так называемых мини-плазмид или  мини-репликонов, конструируемых с  помощью рестриктаз и лигазы из нормальных плазмид или введением в геномы плазмид транспозонов, вызывающих перестройки  в плазмидной ДНК.

Для репликации плазмиды минимально необходима лишь часть плазмиды –  базовый репликон. Наиболее полно  он изучен на примере миниплазмиды F. Он в ней состоит из ряда элементов:

О-пункт – специфическая  последовательность нуклеотидов, на которой  происходит инициация репликации. У  некоторых плазмид несколько O-пунктов (гены ori)

Структурный ген для позитивной функции (ген rep)

Детерминанты, негативно  контролирующие количество плазмид (cop)

Детерминанты, обеспечивающие, распростране-ние копий (par)

Детерминанты ccd.

Что, касается гена rep, то предполагают, что он

Контролирует инициацию  репликации. Посредством про-дукции белка rep E, связывающегося с ori.

С другой стороны, предполагается существование и другой схема, контроля копийности.

Найдено 5 прямых повторов, родственных  повторам в локусе ori, формирующих  локус cop. Считают, что cop конкурирует  с локусом ori за связывание белка repE, который обладает авторепрессорной активностью. Предполагается, что он имеет две формы, одна из которых  имеет значение в инициации репликации, вторая – в репрессии гена rep (авторепрессорная активность).

Репликация плазмиды F и  всех, происходящих от нее, мини-репликонов требует участия белка, кодируемого  хромосомным геном dnaA и являющегося  инициатором репликации бактериальной  хромосомы.

Для плазмиды F характерно наличие  двух O-пунктов репликации – oriS и oriV. С oriS репликация проходит в двух противоположных  направлениях, тогда как с oriV –  только в одном.

У большинства остальных  плазмид репликация проходит по сходным  схемам, с определенными отличиями, так существенные отличия наблюдаются  при репликации P-подобных плазмид.

Распределение между клетками

В процессе деления.

Система распределения существует независимо от генетических структур, контролирующих репликацию. Ее существование  подтверждается идентификацией плазмидных мутаций в виде делеций района par, которые прекращают распределение  плазмид между дочерними клетками, но не влияют на количество их копий  в родительской клетке, т. е. не влияют на копийность.

Как показывают исследования, район par минирепликона плазмиды F имеет  длину порядка 3000 нуклеотидов и  содержит 2 кодирующие последовательности parA и parB, а так же parC, детерминирующий  синтез плазмидной центромеры. Сходная

Структура характерна для  многих плазмид. Последовательности parA и parB кодируют белки, обладающие саморегуляцией на стадии транскрипции (так как  их сверхпродукция привела бы к блокированию распределения). По одной из теорий предполагается, что после репликации плазмиды белки par связываются с  сайтами распределения плазмид, в результате чего образуются комплексы  узнавания. Последние формируют  специфические димеры, которые связываются  с одним из клеточных сайтов. Когда  клетки делятся, то делятся и димеры, в результате чего, плазмидные копии  поступают в новую генерацию  клеток.

Генетическая регуляция.

Внешнее проявление поддержания  плазмид в клетках заключается  в том, что большинство или  все клетки плазмидосодержащей популяции  содержат плазмиды. В случае F, RI и RK2 установлено, что они кодируют летальность  клеток, потерявших плазмиду, т. к. продукты соответствующих плазмидных убивают  клетки, потерявшие их.

Некоторые плазмиды поддерживаются в клетках в количестве 1 – 3 копий  на клетку. Они нуждаются для репликации в ДНК-полимеразеIII и их репликация проходит под строгим контролем  клетки. Другие – в количестве 40–50 копий и используют ДНК-полимеразу I.

Их репликация проходит под  релаксированным контролем. При  делении клетки, дочерние получают не менее 1 копии плазмиды. Так как  считалось, что они реплицируются  на определенной стадии репликации ДНК  бактерии, то, вероятно, существуют контрольные  механизмы. Было предположено, что плазмиды сами регулируют свою репликацию и  распределение, причем система репликации реализуется путем осуществления  двух функций, одна и которых определяет среднее количество копий на клетку, а другая отзывается на изменение  количества и восстанавливает его  до нормы.

Еще в 60-е гг. была предложена гипотеза позитивного контроля. Предполагалось, что плазмида F несет 2 генных локуса, контролирующих процесс. Репликаторный  локус (оператор репликации, репликатор) и структурный ген для синтеза диффузабельной субстанции – позитивного инициатора (эффектора) репликации. Контроль синтеза инициатора модулирует частоту инициации. Для объяснения стойкого наследования клетками плазмиды F в рамках этой модели было предположено так же, что она прикрепляется к тому сайту на клеточной мембране, к которому прикрепляется хромосома. В процессе каждого деления клетки происходит удвоение и мембранного сайта, и хромосомы и плазмидной ДНК. Оба образовавшихся комплекса расходятся в дочерние клетки.

В интегрированном в хромосому  клетки хозяина состоянии, плазмида теряет самостоятельность репликации, которая теперь происходит вместе с  хромосомой хозяина.

В 60-е гг. была выдвинута  так же гипотеза негативного контроля. В соответствии с этой теорией  было предположено существование негативно  действую-щего стойкого ингибитора инициации  репликации. Ингибитор кодируется геном, транскрибируемом немедленно после  инициации репликации и каждое инициаторное событие сопровождается продукцией ингибитора в количестве, достаточном  для подавления любой последующей  инициации до момента, когда концентрация ингибитора уменьшится вдвое в связи  с делением клетки.

В случае плазмиды colE1, установлено, что ингибитор – нестойкие  нетранслируемые молекулы РНКI, которые  негативно контролируют образование  гибридов РНК-прозатравка – ДНК, т. к. связывается с молекулами прозатравки. В норме молекула РНК-прозатравки  соединяется с ее ДНК-шаблоном в  районе O-пункта, далее РНК-аза «плавит» прозатравку, давая начало РНК-затравке, на которую потом добавляется  дезоксирибонуклотиды. Комплекс же РНКI-РНК-прозатрав-ка выключается из процесса.

Определенное влияние  оказывает клетка хозяина. Многие плазмиды для репликации нуждаются в бактериальных  ДНК-полимеразах. Репликация плазмиды pRSF2124 нуждается в бактериальных  эндонуклеазах, контролируемых генами бактериальной хромосомы.

На количество копий плазмид  оказывают влияние вид бактерий, хромосомные гены, культивирование  бактерий. Например копийность плазмид pER2 в E. coli выше нежели чем в коринобактериях.

Экспериментальные данные свидетельствуют, что и в контроле распределения  участвуют гены хромосомы хозяина.

Конъюгационный перенос.

Процесс контролируется опероном tra. В общем виде он представляет из себя:

Образование конъюгационных пар.

Установление специфичных  клеточных контактов.

Перенос начинается с сайта oriT. Перенесенная ДНК может стойко поддерживаться в трансконъюгантах в автономном состоянии либо включаться в хромосомный репликон хозяина  посредством рекомбинации.

Долгое время считалось, что конъюгация – исключительно  свойство Enterobacteriaceae, однако в последние  годы показана ее возможность и у  других микроорганизмов. У Enterobacteriaceae и Pseudomonada-ceae конъюгационный перенос обеспечивается тем, что плазмиды контролируют синтез секс-пилей для контактов. У грамположительных  бактерий не обнаружены, у некоторых  из них контакты между клетками обеспечиваются транспозонами (Streptococcus), фагами (staphylococcus) или экстрахромосомными ферромонами (Enterococcus).

При формировании клеточных  контактов наряду с парами образуются агрегаты, в которых насчитывают  до 13 скрещивающихся клеток. Эффективность  спаривания не зависит от размеров агрегатов. Большинство скрещиваемых клеток способно формировать агрегаты в течение 30 минут, что, как предполагают, — результат роста и деления  клеток, установивших контакты.

Способность спариваться  клеток-доноров с клетками-реципиентами определяется наличием F-пилей у  доноров. Тонкий механизм участия пилей  в формировании клеточных контактов  не выяснен до конца. Одно из объяснений его заключается в том, что последние – структуры, объединяющие конъюгирующие клетки и представляющие из себя трубки, через которые перемещается плазмида в реципиентную клетку. Другое предположение состоит в том, что, после столкновения двух соответствующих микроорганизмов и установления между ними начального контакта, пили действуют как в качестве крючков, взаимодействуя концом с поверхностью клетки реципиента. После дотрагивания пиля втягивается назад в донорскую клетку, чем обеспечивает контакт между клетками по типу «стенка к стенке». Затем формируется конъюгационная трубка.

Что бы быть компетентной в  конъюгации, клетки-реципиенты должны обладать рядом свойств:

Клеточная стенка должна иметь  специфические рецепторы.

Клеточная стенка должна пропускать одноцепочечную плазмидную ДНК.

Внешние факторы оказывают  большое влияние на конъюгацию бактериальных  клеток (состав питатель-ной среды, температура, время культивирования, изменение pH среды: снижение pH от 7.2 до 6.2 ведет к удвоению частоты спариваний).

Плазмидный перенос состоит  из ряда стадий:

Инициация ДНК плазмиды.

Разделение цепей переносимой  ДНК в клетке доноре. Для этого  необходима насечка «надсечка» и  раскручивание макромолекулы, что  обеспечивается эндонуклеазами клетки – никазами.

Перенос цепи. Он осуществляется в направлении от 5’ к 3’-концу, т. е. 3’-конец – ведущий. Перенос  длится 15 – 20 минут.

Конъюгативный синтез в клетке доноре

Репликонация ДНК плазмиды в клетке-реципиете. Репликонация –  конвертирование одноцепочечной ДНК  плазмиды в двухцепочечную.

Репликонация осуществляется в виде 2-х процессов: синтеза комплиментарной  цепи и кольцевания плазмиды. Изучение плазмид F и сol показало необходимость  для конъюгационного синтеза  в клетках реципиентах ДНК-полимеразы III (для синтеза цепи). ДНК-полимеразе для работы необходима затравка, которую  обеспечивает либо РНК-полимераза, либо РНК-примаза.

ДНК плазмид прикрепляется  ко внутренней мембране в реципиентных клетках, где она приобретает  кольцевую форму после синтеза  второй цепи.

Мобилизация – процесс, основу которого составляют метаболические реакции, обеспечивающие подготовку плазмиды к  переносу. Мобилизация присуща как  конъюгативным, так и неконъюгативным  плазмидам. Конъюгативные плазмиды могут мобилизовать на перенос неконъюгативные  плазмиды. Это применяется при  скрещивание даже очень отдаленным видам. Еще в старых работах было показано, что мобилизация на перенос  неконъюгативных плазмид резистентности конъюгативными плазмидами обычно дает трансконъюганты, в которых обе  плазмиды сосуществуют физически неизменными, не ассоциированными. Однако в процессе мобилизации могут формироваться  и стойкие коинтеграты. Например, исследования мобилизации конъгативных плазмид pRQ1 на перенос неконъюгативных  плазмид pRQ2 в клетках S. typhimurium, показало, что она сопровождается формированием  коинтеграта плазмид pRQ6. Коинтегративный  характер последних был подтвержден  тем, что эта плазмида имеет резистентности обеих исходных, ее перенос термозависим, как pRQ1, и она несовместима с обеими исходными.

Существуют плазмиды, которые  проявляют конъюгативные свойства лишь в присутствии реципиентных клеток, синтезирующих секс-ферромоны  – низкомолекулярные полипептиды. Такие плазмиды установлены в  клетках некоторых штаммов E. Faecalis. Они детерминируют лекарственную  резистентность, гемолизины, бактериоцины и др. Ответ донорских клеток на ферромоны — через 20-30 минут. Он заключается  в синтезе белковой фибриллярной иммунологически активной субстанции – адгезина – на поверхности клеток, что обеспечивает формирование агрегатов бактерий. Разным плазмидам соответствуют разные ферромоны.