Плазмиды

План. 

 

I Введение.

II Основная часть.

История исследования плазмид.

Идентификация плазмид.

Классификация плазмид.

Поверхностное исключение и  летальный зигозис.

Несовместимость и группы несовместимости.

Молекулярная и генетическая организация плазмид.

Молекулярная организация  плазмид.

Генетическая организация  факторов переноса.

Генетическая организация  конъюгативных плазмид.

Генетическая организация  неконъюгативных плазмид.

Поддержание в клетках.

Репликация.

Распределение между клетками.

Генетическая регуляция.

Конъюгационный перенос.

Свойства бактерий, контролируемые плазмидами.

Плазмиды лекарственной  устойчивости.

Общая характеристика и механизмы  действия.

Мутации внехромосомных детерминантов  резистентности.

Элиминация R-плазмид.

Лекарственная конверсия.

Продление чувствительности к лекарствам.

Плазмиды бактериоциногении.

Плазмиды и патогенность бактерий.

Атрибуты патогенности.

Плазмиды и патогенность E. coli.

Плазмиды и патогенность других бактерий.

III Заключение.

IV Список использовавшейся  литературы. 

 

Плазмиды – внехромосомные генетические элементы,

Способные к автономному  поддержанию в цитоплазме бактерий или существованию в интегрированном  в хромосому состоянии, откуда они  могут свободно выходить в цитоплазму (иногда с фрагментами хромосомы). Некоторые хромосомы могут распространяться в бактериальной популяции между ее членами. Плазмиды определяют ряд важных свойств бактерий:

Являются факторами фертильности – определяют донорский фенотип  клетки.

Контролируют резистентность к антибиотикам, сульфаниламидам, катионам тяжелых металлов, бактериоцинам, бактериофагам, к сыворотке крови.

Чувствительность к бактериоцинам

Синтез тиамина, пролина, внеклеточной ДНКазы и др.

Синтез антибиотиков и  бактериоцинов.

Метаболизм углеводов, углеводсодержащих  соединений, галогеновых соединений, белков.

Фиксацию азота.

Продукцию токсинов, гемолизина, антигенов колонизации, капсулы.

В последнее время природа  факторов внехромосомной наследственности

Микроорганизмов приобрела  особый интерес в связи с появлением данных о возможности использования  плазмид в качестве векторов эукариотных  генов. Такая возможность открывает  неограниченные перспективы для  генетического моделирования не только при решении проблем молекулярной биологии, но и в практическом аспекте, в частности в медицинской  микробиологии и иммунологии (создание новых бактерийных профилактических и лечебных препаратов) и микробиологической промышленности.

Большой опыт экспериментального мутагенеза на модели бактерий и вирусов  способствовал раскрытию генетических и молекулярных механизмов регуляции  функций внехромосомных элементов. Их способность включаться в хромосому  и формировать комплексы «замещенных» плазмид широко используется в экспериментальной  биологии и генетике. Замещенные плазмиды несут фрагменты хромосомы бактерии-хозяина  и в автономном состоянии функционируют  под контролем регуляторных механизмов бактериальной клетки. Расширение методических и технических возможностей экспериментальных  исследований в области молекулярной биологии позволяет целенаправленно  использовать генетические модели в  решении важных практических задач.

Определились реальные пути более гибкого вмешательства  в процессы физиологически нормального  генетического обмена у бактерий, осуществляемого с участием внехромосомных элементов, способствующих конъюгации, формированию рекомбинантов, передаче генетического материала путем  трансдукции умеренными фагами, мобилизации  нетрансмиссивных элементов плазмидами, имеющими в своей структуре «гены  трансмиссивности», и сочетания  с этими генами фрагментов хромосомы  с последующим переносом вновь  формирующихся структур и их ассоциаций в клетки реципиентов. Актуальное значение приобретает исследование механизмов взаимодействия внехромосомных элементов  с хромосомой и между собой  в естественных или сконструированных  искусственно полиплазмидных системах. Подчинение этих систем общим регуляторным механизмам на уровне клетки и популяции  микроорганизмов выдвигает новые  проблемы: изучение специфических особенностей полиплазмидных популяций при наличии  дополнительных генетических факторов, не обязательных для воспроизведения  жизнеспособного потомства, и возможностей практического использования искусственно обогащенного генома популяций бактерий.

В последнее десятилетие  интенсивно накапливаются данные о  генетической природе и биологических  особенностях плазмид, с которыми непосредственно  связана патологическая активность бактерий. Это – элементы Hly, Ent, Vir, сведения о которых в мало обобщены. Практическое значение в инфекционной патологии приобретают «вторичные»  процессы при ожоговых заболеваниях и постхирургических осложнениях, возникающих в связи с неограниченно  возрастающей множественностнной лекарственной  устойчивостью возбудителей этих процессов, контролируемой трансмиссивными и  нетрансмиссивными факторами инфекционной резистентности. Менее полно изучены, но не менее важны плазмиды, контролирующие патогенные свойства стафилококков, стрептококков, псевдомонад.

В настоящее время на основе использования трансмиссивных эписом интенсивно разрабатывается новое  направление исследований — «генетическая  инженерия» и как

Специальный раздел этого  направления — «генная инженерия». Последняя представляет собой область  прикладной молекулярной генетики и  биологии, развитие которой только начинается. Однако первоисточником  «сырья» для осуществления конкретных задач конструирования новых  биологически активных молекул являются внехромосомные элементы, способные  функционировать в виде самостоятельных  оперонов и репликонов. Они сохраняют  эту функцию в гетерологичных системах микроорганизмов и, что  особенно привлекает «биоинженеров», — в системах эукариотов.

История исследования плазмид.

Начало исследования плазмид  относят к 20 гг. XX века. В 1921 г. Bourdet и Ciuca открыли лизогенные бактерии, способные  спонтанно лизироваться. В 1925 г. Gratia обнаружил фактор, подавлявший рост некоторых видов энтеробактерий – «принцип V». Wollman в 1928 г. высказал предположение о трансмиссивности факторов лизогенности. В 1932 г. Gratia идентифицировал  обнаруженный им фактор, обладавший антагонистической  активностью как белковоподобное  вещество. Это исследование дало начало изучению колициногенности – способности  бактерий E. Coli продуцировать колицины – вещества, подавляющие рост близкородственных  бактерий.

Основываясь на сходстве выражения  бактериоциногенности и лизогенности бактерий, Fredericq (1946) высказал гипотезу об идентичности продуктов летального синтеза, определяющих названные свойства. Согласно его концепции, детерминанты синтеза колицинов представляют собой дефектный бактериофаг, сохранивший  способность летального синтеза, но утративший гены, ответственные за формирование фаговых частиц.

В 1946 г. Д. Ледерберг и Э. Татум использовали смешанное культивирование  ауксотрофных мутантов E. Coli K12 и открыли  конъюгацию бактерий. В дальнейшем было доказано, что при конъюгации часть клеток являются донорами, а  часть реципиентами, что зависит  от присутствия внехромосомного  фактора фертильности: F-фактора, откуда следовал вывод об односторонности  механизма и наличия F+ и F — фенотипов. Дальнейшие исследования показали возможность  превращения клеток F — в F+ в смесях клеток обоих типов, что указывало  на трансмиссивность F-фактора. Было также  доказано существование внехромосомных элементов – «плазмид». Как оказалось  позднее, плазмида (фактор) F является чистым фактором генетического переноса, так  как обладает лишь генами переноса и генами репликации.

Внехромосомная природа  фактора F была доказана на основании  результатов обработки бактерий F+ акридиновыми красителями, что приводит к «удалению» фактора F из клеток популяции  и превращает их из доноров в реципиентов (Hirota, Jidjima, 1956; Lederberg, 1958; Wollman, Jacob, 1956).

Работы 50-х годов показали, что плазмида F может находиться как автономном состоянии (в цитоплазме), так и в интегрированном в  хромосому.

В 1952 г. Lwoff систематизировал материалы по лизогении и впервые  предложил термин «плазмиды» для  обозначения «внехромосомных симбиотических организмов». В настоящее время  этот термин рекомендуется в качестве основного для определения внехромосомных факторов наследственности у бактерий.

В начале 60-х гг. была установлена  возможность выхода плазмиды из хромосомы  в цитоплазму. При этом иногда захватываются  гены хромосомы.

Fredericq (1963) показал связь  колициногенных факторов с факторами  «половой полярности» бактерий  и привел экспериментальные доказательства  возможности рекомбинаций между  внехромосомными элементами и  фрагментами хромосомы бактерии  хозяина.

Открытие во второй половине 50-х годов японскими исследователями  генетических элементов, контролирующих множественную трансмиссивную устойчивость бактерий к наиболее широко применявшимся  антибиотикам и синтетическим химиотерапевтическим препаратам сульфаниламидного ряда, ознаменовало новый этап в изучении внехромосомных факторов наследственности бактерий (Watanabe, 1963; Mitsuchashi, 1960, и др.). Она передавалась в результате клеточных  контактов, независимо от переноса бактериальной  хромосомы. Для обозначения детерминантов  лекарственной резистентности Mitsuhashi S. предложил символ R. Многочисленные исследования в 60 -70-е гг. показали, что R-плазмиды присутствуют в бактериях  многих видов, широко распространены географически, отличаются друг от друга и по генетическому  составу и по фенотипическим проявлениям.

В середине 60-х годов английские исследователи (Datta, 1965; Anderson, 1965; Datta, Meynell, 1965) представили данные о природе  фактора трансмиссивности—RTF, и  его аналога—фактора А, способных  существовать в свободном состоянии  и формировать комплексы с  детерминантами резистентности к отдельным  антибиотикам, не обладающим собственными генами трансмиссивности. Эти исследователи  установили функциональную гомологию  «секс-фактора» и фактора передачи резистентности к антибиотикам, а  также показали филогенетические связи  плазмид резистентности с другими  трансмиссивными плазмидами.

Важное значение для понимания  механизмов передачи внехромосомных элементов  имели исследования поверхностных  структур у бактерий, опосредующих конъюгационную передачу генетического  материала (Brinton, 1965; Meynell, Lawn, 1967). Эти  работы явились основой для дифференцированного  подхода к оценке роли «ворсинок» разного типа в определении групп  совместимости (или несовместимости) факторов резистентности и других внехромосомных элементов. В 1967 г. Smith и соавторы открыли  внехромосомные элементы, непосредственно  контролирующие формирование патогенных свойств у энтеробактерий, выделенных от животных и человека. Был выявлен  трансмиссивный Детерминант гемолитической активности – фактор Н1у в штаммах E. coli животного происхождения (Smith, Halls, 1967).

В той же лаборатории обнаружен  самостоятельный внехромосомный элемент, контролирующий синтез энтеротоксина  — плазмида Ent (Smith, Linggood, 1971).

Д. Г. Кудлай и соавт. (1969) выявили  трансмиссивный элемент Н1у, контролирующий синтез гемолизинов типа р и токсических  веществ, вызывающих дермонекрозы и  гибель лабораторных животных, у штаммов E. coli, выделенных от человека при токсической  диспепсии.

В 70-е гг. появляются сведения о детерминированной резистентности к тяжелым металлам, о контроле плазмидами метаболизма липополисахаридов  и других компонентов клеточной  стенки бактерий, синтеза токсинов, бактериоцинов, синтеза различных  ферментов. В 80-е гг. были открыты  полиплазмидные системы переноса плазмид.

В России исследования плазмид  были начаты в конце 50-х гг. в лабораториях Д. Г. Кудлай и А. П. Пехова.

Идентификация плазмид.

Идентификация на генетическом уровне.

Этот метод идентификации  основан на учете фенотипов исследуемых  бактерий (свежих изолятов) по сравнению  с фенотипами известных штаммов, а так же на последующем установлении трансферабельности интересующего  свойства к другим бактериям.

Что бы проверить, детерминируется  ли отличающий признак плазмидой, прибегают  к конъюгационным скрещиваниям резистентных клеток (доноры) с чувствительными  клетками (акцепторы). Положительный  результат в форме наблюдения конъюгации и селекции резистентных трансконъюгантов означает, что лекарственная  устойчивость в исследуемом случае трансмиссивная.

При получении отрицательных  результатов, сначала делают предположение, что признак контролируется неконъюгативной  плазмидой. В этом случае пытаются провести мобилизацию на перенос исследуемую  плазмиду известной конъюгативной  плазмидой.

Если и этот тест не дал  положительных результатов, то предполагают, что возможно, по каким-то причинам, плазмида оказалась недоступной  для мобилизации. Вопрос о плазмидной резистентности в данном случае решают в зависимости от результатов  экспериментов по трансдукции.

Установление плазмидной резистентности должно сопровождаться исключением резистентности, контролируемой транспозируемыми генетическими элементами (транспозонами).

В тех случаях, когда исследуемый  признак легко обнаруживается при  изучении отдельных колоний, дополнительную информацию может дать изучение стабильности плазмид. При этом исследуют как  спонтанную элиминацию плазмид (следствие  ошибок репликации или распределения  между дочерними клетками плазмидных копий, что с трудом поддается  математическому учету), так и  индуцированную. К индуцированной элиминации прибегают тогда, когда спонтанная элиминация происходит с чрезвычайно  низкой частотой. Обычно используют акридин  оранжевый или этидий бромид. Универсального элиминационного химического агента к настоящему времени не найдено, поэтому обычно прибегают к комбинированной  обработке различными химическими  веществами.