Плазмиды

Если резистентность детерминируется  хромосомно, то мутация, сопровождающаяся утерей признака, может ошибочно указать  на плазмидный контроль признака. В  этом случае прибегают к индукции обратных мутаций, что позволит исключить  ложное предположение.

Для идентификации F-подобных факторов генетического переноса прибегают  к использованию реакции нарастания титра F-дононорспецифических фагов (РНТФ) в культурах исследуемы бактерий, которые не имеют видимых свойств, указывающих на содержание в них  плазмид. Положительная РНТФ указывает  на присутствие в клетках фактора  переноса.

Значительно сложнее осуществлять идентификацию и определение  типовой принадлежности плазмид  в бактериальной клетке, которые  могут содержать комплексы плазмид, состоящие из нескольких плазмид  разных типов, включая F-факторы. В таких  случаях прибегают к «разгонке» плазмид с помощью скрещиваний  или физических методов с последующей  генетической характеристикой каждой плазмиды.

Идентификация на молекулярном уровне.

Идентификация плазмид в  этом случае производится путем выделения, очистки и характеристики плазмидной ДНК, количество которой в плазмидосодержащих клетках составляет около 5% тотальной  ДНК клетки.

Основная сложность в  выделении ДНК плазмид – отделение  от хромосомной ДНК.

Это достигается с помощью  ультрацентрифугирования в градиенте  плотности хлористого цезия.

В исследованиях используют метод электрофореза, с помощью  ферментов-рестриктаз получают физические карты плазмид. Молекулярная масса  ДНК плазмиды определяется с помощью  определения контурной длины  молекулы используя электронную  микроскопию.

Распространение плазмид.

Плазмиды в диких бактериальных  популяциях распространены очень широко и их можно выявить у бактерий по всей планете.

Плазмиды выявляются во многих видах грамотрицательных анаэробов  и аэробов, неспоровых анаэробов, кокков, коккобацилл, грамположительных неспоровых палочковых форм и кокков, споровых палочек и кокков, актиномицетов  и родственных форм, микоплазм, спирилл, миксококков, фототрофов, цианобактерий, одноклеточных водорослей, дрожжей, трипаносом и т. д.

Классификация плазмид.

В 50-е гг. плазмиды R стали  классифицировать на fi+ и fi- (по способности  ингибировать перенос плазмиды F). Далее  стали, в зависимости от различия в пилях, выделять F и I-подобные плазмиды.

Современные подходы к  классификации плазмид основаны на комплексном учете их генетических свойств.

Еще в ранних работах по изучению плазмид было замечено, что  существуют факторы, препятствующие конъюгационному  переносу плазмид от доноров к  реципиентам, содержащим одинаковые и  сходные плазмиды. Один из таких  факторов – поверхностное исключение: в скрещиваниях плазмида не переходит  из клеток доноров в клетки реципиенты, содержащие сходную плазмиду. В результате поверхностного исключения перенос  снижается в 10-400 раз по сравнению  с нормой. Следующий фактор был  открыт в 60-е гг. – летальный зигозиз. Смешивание клеток доноров с клетками реципиентами, добавленными в смесь  в значительно меньшем количестве, чем клетки доноры, сопровождается снижением числа жизнеспособных зигот, наследующих донорский генетический материал. Наконец результативность переноса зависит от несовместимости  плазмид. В наиболее простом виде несовместимость заключается в  том, что при переносе одна из плазмид  элиминируется. Если в клетке обе  плазмиды сохраняются, то это указывает  на их совместимость. Обычно несовместимы те плазмиды, контроль репликации которых  одинаков.

Поверхностное исключение и  летальный зигозиз.

Поверхностное исключение (sfx) лучше всего исследовано в  случае F-плазмид. Экспериментальные  данные свидетельствуют, что это  свойство плазмид F детерминируется  генами tra S и tra T. Мутации этих генов  снижают sfx в 15-20 раз. Изучение роли белка tra T плазмид F показало, что этот белок  либо снижает частоту формирования стойких клеточных агрегатов  в процессе скрещивания клеток, либо связан с концом f-пили, предупреждая взаимодействие последней с поверхностью клетки реципиента. Белок tra S подавляет  запуск конъюгационного метаболизма  ДНК.

Клетки доноры F+ становятся фенокопиями F — в поздней стационарной фазе развития при культивировании  и имеют реципиентную способность. В фенокопиях продукт гена tra T также  синтезируется, однако функционально  не активен.

Поверхностное исключение обнаружено также в случае I-подобных плазмид.

Летальный зигозиз может  проявляться если в скрещиваниях используются клетки реципиенты F-. Однако, если клетки, используемые в качестве реципиентов, содержат плазмиду F —  они имунны к летальному зигозису.

Несовместимость и группы несовместимости.

К одной группе несовместимости (inc-группа) относят плазмиды, которые  несовместимы между собой, но совместимы с любой плазмидой из другой группы.

Существует более 30 inc-групп:

Группа	Плазмида
B	R16, Tpll3, Tpl25, R723, R864a
C	R40a, R55, RAl, pIP55, pIP40a, pHH1343a
D	R711b, R778b
E	JA4320
F1	F, ColV2, ColV2-K94, ColV3-K90, ColV3, R386, R455, R773, R162, P307Ent, IP162, pAPl0-2, plP174, pHH507, PGH2387
FII	R192, NR1, Rl, Rldrdl9, R6, R6—5.1, SF119, R136, Rl-19k, R538Fdrdl, pHH1313d, pGD10
FIII	ColB-K98, MIP240Hly, R ColBM
FIV	R124, pJLl/Vir/, pAP17
FV	Folac, plT509, pIE1510
FVI	Hly-P212, pGL611, pSU212Hly, pSU105, Hly
FVII	PAP38
FVIII	PAP43
FIX	PAP42
FX	PAP19-1
G	Rmsl49
HI1	R27, R726, pPG 1251-2, TP123
HI2	R478, pAS251-2, pSD114. N-1, pWR23
HI3	MIP233
HII	PHH1457, pHH15O8a, pHH1532b-l, R62, R64, R144, R483, ColIb-P9
Il/I	R62, R64, R144, R483, ColIb-P9
Ig	R621a, ColIb-Iml420
Id	JR66a, R721
It	R905a
I2	TR114, R769, pHlyl52
J	R391, R997
K	R387, pTM559, pIE316, pkmr
M	R69, R446b, R471a, R831b, R46, pDT201,R390
N	N3, N3T, R15, R46, R477b, pKM10l, PCU1, RPC3, pIP113, R390
P	RP4, R751, R690, RP1, R18, pUZ8, pK2, R68, R702, R906
Q	R678, NPT7, R300b, NTP2, R839, R938, R995, R1033, RSF1010, R1I62, pKT214, R702, R751, R906, R772
S	R1033, R751, R906, R772
T	Pts-1, R394, R401, R402
U	PAr-32, pA3, R1460, pIE42O
V	R757, R753
W	RSa, R7K, R388, plP100b, pIP339
X	R6K, R485, TP231, TP228, TP227, R711b, TEMdrd, pHH1187
Y	PIcm P7, R753, R905, PI5b, pIP231, MIP231

Когда плазмиды не трансмиссивны  в E. Coli их классифицируют в бактериях  тех видов, в которых они выявлены. Плазмиды псевдомонад, не способные  к переносу в E. Coli, классифицированы в Pseudomonas aeruginosa и других псевдомонадах  на 11 групп.

Плазмиды стрептококков  и стрептомицетов также классифицированы на несколько inc-групп.

Для плазмид одной группы исключения сходна молекулярная масса, гомологичны многие последовательности нуклеотидов, сходны конъюгационные процессы, синтезируются серологически родственные  пили. Как полагают многие исследователи, принадлежность плазмиды к той или  иной группе несовместимости является отражением филогенеза последней.

Иногда проявляется атипичная  несовместимость, когда плазмиды оказываются  несовместимыми с плазмидами других групп несовместимости. Иногда одну плазмиду относят к нескольким inc-группам.

На данный момент предложено две модели механизма несовместимости:

Репликоновая – основана на гипотезе позитивного контроля. Предполагается, что несовместимость  обуславливается конкуренцией плазмид  за сайты прикрепления к мембране клетки. Однако, к настоящему времени  имеются данные, не укладывающиеся в такую модель.

Модель «разведения репрессора»  — негативный контроль. Если плазмиды имеют одинаковые системы контроля копийности и, следовательно, обладают взаимной чувствительностью к детерминированию и репрессорам, то они будут несовместимы (т. к. в дочерние клетки разойдутся не копии одной плазмиды, а гомологичные несовместимые плазмиды, а синтез копий до деления клетки и тем  самым разведения репрессора будет  подавлен)

Молекулярная и генетическая

Организация плазмид.

Генетическая организация  разных плазмид отличается большим  разнообразием, так как среди  плазмид, на основе их функциональной специфичности, различают факторы  генного переноса, представляющие собой  структуры, содержащие лишь гены репликации и переноса, благодаря которым  обеспечивается непрерывность поддержания  плазмид этого типа и распределение  их между дочерними клетками, а  так же их трансмиссивность и генетические детерминанты различных свойств.

Конъюгационные коинтегративные  плазмиды – коинтеграты, состоящие  из фактора генного переноса(RTF) и  генов, детерминирующих фенотипические свойства бактерий. Каждый из составных  компонентов такой плазмиды содержит в своем геноме гены репликации.

Неконъюгационные плазмиды — генные детерминанты различных  свойств. В бактериальных клетках  они лишены способности придавать  клеткам свойства генных доноров (они  не способны к самостоятельной передаче, но, благодаря наличию генов репликации, стабильно поддерживаются в клетке и передаются дочерним клеткам).

Молекулярная организация.

Плазмиды – молекулы ДНК, с размерами от 1   350 МД и более (1000  550000 нуклеотидов). Чаще всего размеры лежат в пределах от 3   6 МД и от 50  70 МД (последнее множество размеров принадлежит конъюгационным плазмидам).

Молекуле плазмидной ДНК  присущи различные конформации: может быть 2-хцепочечная кольцевая  форма (в результате смыкания одной  из цепей ДНК – «релаксированная»  форма), в результате смыкания обеих  цепей образуется ковалентно закрытая сверхспиральная кольцевая форма.

Конформации плазмидной ДНК (суперспирализованная, линейная и  кольцевая релаксированная)

Для большинства бактерий и плазмид обычна суперспирализированная форма. У микроорганизмов ряда видов  встречаются плазмиды в линейной форме, например, у стрептомицетов –  плазмида SCP1.

Значительная часть сверхспиральной  ДНК отдельных плазмид находится  в «релаксационном» комплексе с  белком.

Кольцевая форма молекулы ДНК плазмиды характерна лишь для  бактерий, но не для грибов и растений, где она существует в линейной форме.

Генетическая организация

Факторов переноса.

К чистым факторам переноса относят, например, факторы F и F-подобные (pAP22-4, pAP38, pAP39, pAP41) и pTRA1, фактор T, идентифицированный в E. coli, Shigella, Salmonella, Proteus, Klebsiella, Aerobac-ter, фактор D, обнаруженный в S. typhimurium, и pAA1000 – в S. suipestifer (Пехов А. А. 1981), в Pseudomonas – фактор АP, а в Vibrio – фактор P и др. Наиболее полно их генетическая организация изучена на примере F-плазмиды, у которой не только изучены  гены переноса – tra, репликации – rep, несовместимости  – inc и др. но и картированы. Имеется 22 гена tra: M, J, A, L, E, K, B, V, C, W, U, N, F, H, G, S, T, D, I, Y, Q, Z. Гены tra A, L, E, K, B, V, C, W, F, Q, H, G –  детерминируют синтез белков F-пилей, например, F-подобные pED208 – детерминируют  синтез 17 пилей (в случае 0.5 – 1.5 пили в среднем на клетку), гены tra N и G детерминируют устойчивость конъюгационных пар клеток (донор – реципиент), tra M, Y, G, P, I, R, U – контролируют метаболизм конъюгации, tra S, T – поверхностное  исключение, tra J — генетическая регуляция  переноса плазмид.

Генетическая организация  конъюгативных

Коинтегративных плазмид.

Эти плазмиды представляют из себя коинтеграты факторов переноса и детерминантов различных свойств, контролируемых плазмидой. С этой стороны  наиболее полно изучена F — и I-подобные плазмиды лекарственной резистентности. R-плазмиды – коинтеграт 2 макромолекул (RTF + генетические детерминанты r). Основной тип фактора R является сложной структурой, в которой несколько генетических элементов объединено в одну кольцевую  макромолекулу.

Альтернативные молекулярные формы фактора R3W.

Единая структура раздельные компоненты

репликона

В некоторых случаях в  коинтеграты входят несколько элементов, способных к независимой репликации (имеют rep-гены). Таким образом, коинтеграты  в клетке хозяина могут быть стабильными (I вариант) и разделенными на отдельные  репликоны (II случай). Имеющиеся данные свидетельствуют, что система переноса F-подобных R1, RG, R100 в принципе сходны с F плазмидой и имеют сходные  наборы и последовательности генов tra, и детерминируют синтез сходных (толстые, гибкие) пилей.

Система переноса I-подобных плазмид сходна с системой F-подобных, однако, для нее характерны особенности: синтез толстых и тонких пилей, морфологически и антигенно-отличных от F-индуцируемых и др. У других inc-групп также  встречаются отличия.

Цитоплазматические элементы, обладающие естественной способностью автономной репликации и самопередачи, могут «выхватывать» из хромосомы  отдельные гены, контролирующие синтез какого-либо вещества, или фрагменты, включающие несколько генов. Трансмиссивные элементы, не нагруженные генами, контролирующими  резистентность к лекарственным  веществам (типа фактора А Андерсона), теоретически также могут быть интегрированы  с хромосомой в локусах, расположенных  рядом с хромосомными генами, контролирующими  лекарственную устойчивость. При  переходе из интегрированного состояния  в автономное трансмиссивный элемент  может включать в свою структуру  прилегающий к нему участок хромосомы, несущий гены резистентности. Путем  последовательной «достройки» трансмиссивного  элемента может образоваться новая  генетическая структура с несколькими  генами резистентности плазмиды R. В  отношении реальности такого пути формирования новых факторов резистентности высказываются  критические соображения, хотя генетические доводы относительно возможности возникновения  плазмид коинтегрированного типа не противоречат гипотезе «выхватывания  генов».

Одно из соображений, не укладывающихся безоговорочно в концепцию, заключается  в том, что механизмы резистентности, контролируемой плазмидами R, часто  существенно отличаются от механизмов формирования хромосомной резистентности. В первом случае факторы R включают гены, контролирующие синтез энзимов, инактивирующих антибиотики, тогда  как соответствующая хромосомная  резистентность

возникает в результате модификаций  рибосомальных структур.

Правомерна и другая теоретическая  модель, несколько отличающаяся от рассмотренной выше. Ее построение основано на том, что у многих видов  бактерий в цитоплазме присутствует внехромосомная ДНК в виде независимо реплицирующихся автономных репликонов. Некоторые из них могут нести  функции фактора передачи или  иметь форму неинфекционного  внехромосомного элемента, например, обладающего антагонистической  активностью (как факторы колициногенности). В структуре таких репликонов возможно наличие генов, контролирующих резистентность к антибиотикам, или  солям тяжелых металлов. Присутствие  в клетке трансмиссивных плазмид  создает условия для передачи неинфекционных плазмид путем их мобилизации. Аналогично этой ситуации присутствие независимого фактора  передачи и независимого неинфекционного  фактора лекарственной устойчивости в одной клетке может быть основой  для. формирования генетического элемента со свойствами фактора R, обладающего  одновременно инфекционностью и  способностью, контролировать лекарственную  устойчивость. В некоторых случаях  возможна последующая интеграция отдельных  репликонов с другими, в результате чего могут сформироваться сложные  репликоны со структурами плазмидных коинтегратов. При отсутствии коинтеграции возможно формирование генетических комплексов, которые могут быть отнесены к типу плазмидных «агрегатов».