Отъёмно–доливное культивирование микроорганизмов – продуцентов

В результате детального изучения ацетоно-бутилового брожения Шапошников (1939) обнаружил, что оно имеет двухфазный характер.

В течение первой фазы происходит активный рост культур и накопление в среде преимущественно органических кислот. Во вторую фазу рН среды снижается, рост культур замедляется, Преобладает образование нейтральных продуктов, а именно ацетона, бутанола и этанола. В то же время количество органических кислот в среде может даже уменьшаться (рисунок 2).

Рисунок 2 – Динамика  ацетоно-бутилового брожения (по Шапошникову, 1948)

1 - общее количество нейтральных продуктов, 2 - ацетон, 3 - кислотность, 4 - газовыделение

Аналогичная двухфазность, как было установлено в дальнейшем, характерна для большинства процессов брожений, а также некоторых других микробиологических процессов, что важно знать для их практического применения.

Для ацетоно-бутилового брожения четко показано, что его двухфазность связана с рН среды. Если значение рН среды в результате накопления органических кислот падает до 4,5 и ниже, начинается интенсивное образование нейтральных продуктов. В результате этого предупреждается дальнейшее подкисление среды, неблагоприятное для бактерий. Если значение рН среды путем добавления в нее мела или другими способами поддерживать на уровне 5,0 и выше, то образования в большом количестве ацетона, бутанола и этанола не происходит.

Установлено, что при низких значениях рН у С. acetobutyliсит увеличивается активность ферментов, катализирующих превращение ацетоацетил-КоА в ацетон (рисунок 2) и больше НАДН используется на/восстановление бутирил-КоА до бутанола. Кроме того, бутанол может частично синтезироваться из ранее образованной масляной кислоты, вновь поступающей в клетки из среды и превращающейся в бутирил-КоА. Поэтому для получения в большом количестве нейтральных продуктов важно соблюдать определенные условия процесса брожения.

3.2 Производственные среды

Ацетоно-бутиловое  брожение  в   производственных   условиях   может вестись на разных углеводсодержащих средах.   Вначале обычно использовали среды, содержащие кукурузную,   пшеничную или ржаную муку. В настоящее время в качестве основного сбраживаемого субстрата нередко применяют мелассу и некоторые другие дешевые вещества. Сбраживаемые углеводы не подвергают предварительному осахариванию. Поэтому содержащие их среды именуются заторами (в отличие от сусла — осахаренной среды спиртового брожения).

Обычно используют заторы, содержащие около 6 % углеводов. Использовать среды с большем количеством сбраживаемых субстратов нецелесообразно, так как образуемый при брожении бутанол уже в концентрации 1,5 % подавляет жизнедеятельность бактерий и брожение прекращается. Поэтому часть углеводов, если их много, остается неиспользованной.

В случае, когда в качестве субстрата для брожения применяют муку, ее предварительно взвешивают на автоматических весах, а затем через дозатор направляют на смешение с водой при 50 - 60°С. Замес проходит ловушки для улавливания комков, а также случайных примесей и поступает на разваривание в варочно-стерилизационные колонки, где нагревается паром до 145 - 160°С и выдерживается при Такой же температуре в трубчатых вертикальных сосудах от 20 до 40 мин, постепенно продвигаясь по ним. Проходя через сепаратор пара, затор подается центробежным   насосом   в  холодильник типа   «труба   в  трубе», охлаждается до температуры брожения (35 - 36°С) и поступает в бродильное отделение.

Среды, содержащие мелассу или гидролизаты растительных отходов, стерилизуют в более мягких условиях (115 - 120°С, 18 - 20 мин), после чего их смешивают с мучным затором.

Для нормального проведения процесса ацетоно-бутилового брожения важно, чтобы в среде имелись в достаточном количестве белки, как это имеет место в мучных заторах.

3.3 Поддержание культуры бактерий и подготовка инокулята

Для выращивания чистой культуры С. acetobutylicum пользуются запасом спор бактерии, заготовляемым обычно на шестимесячный  (и более) период работы завода.

Заготовку спор проводят на 6 %-ном заторе кукурузной или ржаной муки путем массового высева. Для этого около 100 пробирок со свежим стерильным затором засевают культурой бактерии и весь цикл брожения, заканчивающийся образованием спор, проводят при 37°С. Готовить споры можно и способом разлива. Для каждой новой заготовки используют споры, полученные из культур, давших в производстве наилучшие результаты брожения. Первая половина брожения проводится в одном большом стеклянном сосуде, из которого бражка разливается затем в стерильные пробирки, в которых процесс заканчивается образованием спор. Пробирки со спорами запаивают на газовой горелке и ставят в термостат. Через 48 - 60 ч бродильные газы спускают, пробирки вновь запаивают и хранят при комнатной температуре. После двухмесячного хранения партия спор подвергается проверке путем пробного брожения. Удовлетворяющие техническим условиям споры признаются пригодными для производства и на них составляют паспорт.

Приготовление требуемого количества чистой культуры бактерий для производства состоит из ряда последовательных пересевов, которые ведутся во все увеличивающихся объемах затора. Разведение культуры начинается с посева спорами в аппарате чистой культуры (АЧК) объемом 10 л. Через 28 ч брожения содержимое АЧК стерильно передается в большой инокулятор (БИН) на 3,5 м3 затора. Стерильный затор для БИН берут непосредственно с производства в горячем состоянии, охлаждают его в БИНе или в холодильнике. Из инокулятора культура бактерий передается в ферментатор-активатор производственной батареи с соблюдением условий стерильности.

Для процесса непрерывного ацетоно-бутилового брожения предложена дополнительная стадия. Это аппарат чистой производственной культуры (АЧПК), емкостью 200 м3, который засевается из БИНа, а спустя 10 - 12 ч брожения вся культура из него переводится в первый ферментатор производственной батареи и сразу начинается ее загрузка затором.

3.4 Брожение

Для понимания специфики ацетоно-бутилового брожения полезно вначале рассмотреть закономерности периодического процесса, хотя в промышленности оно давно ведется в основном полунепрерывным и непрерывным методами. Уже в первые часы после инокулирования затора активной культурой бактерий наблюдается брожение, заметное по пузырькам газа, поднимающихся к поверхности среды. Газовыделение достигает максимума обычно через 24 - 26 ч, спадая к концу брожения. В период максимального газовыделения происходит характерное расслоение субстрата — на поверхность поднимается рыхлый слизистый слой, в нижнем слое остается мутноватая опалесцирующая жидкость. Вся среда приобретает желтоватую окраску. Это явление в производстве именуется «подъемом» бражки и характеризуется как один из признаков нормального брожения. К концу брожения поднявшаяся твердая часть субстрата оседает на дно. Наряду с газовыделением, характерным для ацетоно-бутилового брожения, является форма кривой титруемой кислотности. Развитие бактерий характеризуется быстрым нарастанием титруемой кислотности, достигающей максимума (4,0 - 4,6 мл 0,1 н NaOH на 10 мл бражки) к 12 - 16 ч брожения, и затем резко снижающегося к 24 - 25-му часу, после чего снова происходит небольшой подъем кислотности к концу брожения. В процесс повышения кислотности рН среды снижается с 6,0 до 4,1 - 4,2 и остается на этом уровне с небольшими колебаниями.

Образование ацетона и спиртов начинается примерно с 6-го часа брожения, но наиболее интенсивно происходит после перелома кривой кислотности. В ацетон и спирты превращается 33 - 35% углеводов и в конечной бражке содержится около 2% растворителей.

Полунепрерывный метод брожения в ацетоно-бутиловом производстве, известный под названием батарейного, имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим и прочно укоренился в нашей промышленности. Батарея состоит из 6 - 8 ферментаторов, последовательно соединенных переточными трубами. Головной из них — активатор, засевают культурой из инокулятора и после перелома кривой кислотности (примерно через 12 ч) начинают загружать мучным затором. Через активатор заполняется вся батарея. Разгрузка батареи (передача бражки на ректификацию) производится с последнего — хвостового ферментатора; после стерилизации он становится активатором следующей батареи, состоящей из тех же ферментаторов, но загружаемых в обратном направлении.

Непрерывное брожение облегчило замену больших количеств муки (до 70%) более дешевым сырьем: свеклосахарной патокой (мелассой) и гидролизатами отходов растительного сырья.

Для первой фазы брожения целесообразнее применять мучной затор, что обеспечивает быстрый рост бактерий  и образование ферментов для синтеза растворителей.

Рисунок 3 – Двухпоточная схема непрерывного ацетоно-бутилового брожения

 Мучной затор:  1 - заторный чаи; 2 - подогреватель ангора; 3 - ловушка; 4 - насос; 5 – варочная колонна; 6 - выдерживатель;  7 -ннросспаратор; 8 - насос; 9 – холодильник; Паточно-гидролизатпый затор: 10 - заторный чан; 11 - лопушка; 12 - насос; 13 - подогревательная колонки; 14 – выдерживатели; 15 - паросепаратор; 16 - насос; 17 - холодильник; 18 - АЧПК; 19,  20 - первый  и  второй  ферментаторы  батареи;  21-23 - ферментаторы батареи;  24 — насос для подачи бражки на ректификацию.

Мелассу и гидролизаты вводят при переходе брожения во вторую фазу.

Разработана двухпоточная схема непрерывного брожения (рисунок 3). При этой схеме мучной и паточно-гидролизатный мучной затор направляется в первый (головной) ферментатор батареи, а также на разведение чистой культуры в инокулятор и АЧК; мелассный затор — во второй ферментатор, где происходит переход во вторую фазу брожения.

В результате внедрения способа непрерывного брожения на Нарткалинском ацетоновом заводе при переработке смешанных заторов (с заменой 70% муки) по сравнению с прежней полунепрерывной схемой брожения мучных заторов производительность заметно возрастала. Весь процесс ацетоно-бутилового брожения, будь то периодический, полунепрерывный или непрерывный, ведется в строго стерильных условиях, в герметически закрытых ферментаторах под небольшим избыточным давлением (0,4·106 - 0,8·105 Па), создаваемым газами брожения. Выделяемые при брожении газы удаляются через специальные коммуникации. Газы выбрасываются в атмосферу или направляются на переработку (например, в жидкую углекислоту или сухой лед).

3.5 Инфицирование в условиях ацетоно-бутилового брожения

Ведение ацетоно-бутилового брожения с применением чистой культуры бактерий в условиях стерильности сред и всего оборудования обусловлено опасностью инфекции. Наибольший ущерб наносят производству молочнокислые бактерии и бактериофаг, быстро и полностью подавляющие рост ацетоно-бутиловых бактерий. Главная причина попадания бактериофага в производство определяется тем, что он легко задерживается в трещинах сварных швов ферментаторов, трубопроводах и других плохо прогреваемых и порой незаметных участках оборудования. Кроме возможного устранения таких участков наиболее эффективной мерой борьбы с бактериофагом является стерилизация при 120°С не менее 20 мин. В результате внедрения способа непрерывного брожения в ацетоно-бутиловом производстве разработан комплекс мероприятий, позволяющих значительно улучшить условия стерильности и сократить случаи инфицирования в процессе брожения.

3.6 Перегонка ацетоно-бутиловой бражки

Ацетоно-бутиловая бражка кроме ацетона, бутилового и этилового спиртов содержит ряд побочных продуктов, для разделения которых применяют довольно сложную перегонку и ректификацию. Изложим только принципиальные особенности этих операций.

На бражной колонне дистиллат всех (трех) растворителей отделяется от ацетоно-бутиловой барды. Дистиллат укрепляется до концентрации около 50% и поступает на ацетоновую колонну для отделения ацетона — продукта с наиболее низкой температурой кипения (56,2°С). Затем на другой колонне отделяют этанол (температура кипения 78,4°С). Несколько сложнее обстоит дело с выделением и обезвоживанием бутанола. Смесь бутанола и воды образует два слоя: верхний — раствор воды в бутаноле (80% бутанола и 20% воды), его называют «богатой смесью» и нижний — раствор бутанола в воде (8% бутанола и 92% воды), его называют «бедной смесью». Разделение смесей производится в сосуде - разделителе. Перегонка и обезвоживание бутанола основаны на его свойстве перегоняться вместе с водой (водяным паром) в виде азеотропной смеси, кипящей при 93,4°С и содержащей 59% бутанола и 41% воды. Таким образом, при перегонке «богатой смеси» с верхней части колонны вся вода удаляется в виде азеотропной смеси, а с нижней части отходит безводный бутанол, который затем окончательно очищается на бутаноловой колонне (температура кипения бутанола 117,7°С). При перегонке «бедной смеси» из нижней части лютерной колонны отходит лютерная вода, а с верхней части — азеотропная смесь, направляемая потом в соответствующий сосуд — разделитель. Основной отход ректификации и всего производства - барда, содержит около 3% сухих веществ, состоящих главным образом их азотистых соединений сырья. Ранее барда использовалась обычно для откорма скота, но затем на ряде заводов были построены дрожжевые цехи для выращивания на барде кормовых дрожжей.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4 ОСНОВНЫЕ ПУТИ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ПРОЦЕССОВ БИОСИНТЕЗА В ТОМ ЧИСЛЕ ПРОДУКТОВ АЦЕТОНО-БУТИЛОВОГО БРОЖЕНИЯ

В результате внедрения способа непрерывного брожения в ацетоно-бутиловом производстве разработан комплекс мероприятий, позволяющих значительно улучшить условия стерильности и сократить случаи инфицирования в процессе брожения.

В результате внедрения способа непрерывного брожения на Нарткалинском ацетоновом заводе при переработке смешанных заторов (с заменой 70% муки) по сравнению с прежней полунепрерывной схемой брожения мучных заторов производительность заметно возрастала.

Непрерывное брожение облегчило замену больших количеств муки (до 70%) более дешевым сырьем: свеклосахарной патокой (мелассой) и гидролизатами отходов растительного сырья.