Отъёмно–доливное культивирование микроорганизмов – продуцентов

Бутанол, ацетон образуются при сбраживании глюкозы клетками Clostridium acetobutylicum. При этом вначале выделяется также масляная кислота; однако по мере подкисления среды начинают синтезироваться ферменты (в том числе ацетоацетатдекарбоксилаза), действие которых приводит к накоплению ацетона и бутанола. Процессы образования этих веществ тесно связаны между собой. В результате декарбоксилирования части ацетоацетата утрачивается потенциальный акцептор водорода, который при восстановлении в бутират мог бы дважды присоединить 2[Н]. Этот водород так или иначе должен быть передан другим акцепторам, в том числе и только что образовавшемуся бутирату. Для восстановления до бутанола бутират должен быть сначала активирован путем превращения в бутирил-СоА. При брожении в щелочной среде С. acetobutylicum ведет себя как С, butyricum.

1.3 Химизм образования ацетона, бутанола масляной кислоты  при ацетонбутиловом брожении

Химизм ацетонобутилового брожения еще недостаточно выяснен. В последнее время для изучения его используют метод меченых атомов. В бродящую среду вводят промежуточные продукты брожения (уксусную, ацетоуксусную и масляную кислоты), содержащие углерод С13, а затем определяют наличие этого углерода в конечных продуктах. Этим способом установлено, что при добавлении уксусной кислоты с С13 около 50% всего меченого углерода содержится в бутиловом спирте, около 15%- в ацетоне, до 18% - углекислом газе. При добавлении масляной кислоты, содержащей С13, около 85% меченого углерода переходит в бутиловый спирт. Он найден также в этиловом спирте, в уксусной и масляной кислотах. Исходя из этих данных, считают, что образование бутилового спирта идет главным образом через масляную кислоту. Кроме того, полагают, что ацетон образуется через масляную кислоту.

Первые стадии брожения  до образования ацетольдоля протекают подобно маслянокислому брожению. Далее между двумя молекулами ацетальдоля протекает окислительно – восстановительная: оксимасляная кислота и оксибутиловый спирт по следующему уравнению: реакция, в результате которой образуются два соединения: β - оксимасляная кислота и β - оксибутиловый спирт по следующему уравнению:

2СН3СНОСН2СНО + Н2О → СН3СНОНСН2СООН + СН3СНОНСН2СН2ОН

β - Оксимасляная кислота далее отщепляет водород и переходит в ацетоуксусную кислоту, которая затем распадается на ацетон и углекислый газ:

СН3СНОНСН2СООН → СН3СОСН2СООН → СН3СОСН3 + СОв –

оксибутиловый спирт подвергается восстановлению до n - бутилового спирта согласно уравнению:

CН3СНОНСН2СН2ОН + Н2 → СН3СН2СН2СН2ОН + Н2О

Часть уксусного альдегида, по-видимому, также вовлекается в окислительно-восстановительную реакцию с образованием уксусной кислоты и этилового спирта:

СН3СНО + СН3СНО + Н2О →СН3СООН + СН3СН2ОН

Рисунок 1 – Схема ацетоно-бутилового брожения

1 — фосфотраисферазная система фруктозобнсфосфатного пути; 2 — пируват: ферредоксин-оксидоредуктаза; 3 — гндрогеназа; 4 — ацетоацетилтрансфераза (тнолаза); 5 - L (+)-β-гидрокснбутнрил-КоА-дегндрогеназа; 6— L-3-гидроксиацетил-КоА-гидролаза (кротоиаза); 7 — бутнрил-КоА-де-гндрогеиаза; 8 — КоА-трансфераза; 9 — фосфотрансацетилаза; 10 — ацетаткиназа; 11 — бутирилальдс-гиддегидрогеназа; 12 — бутанолдегидрогсназа; 13 — КоА-трапсфераза; 14— ацетоацетатдекарбоксилаза; Фд — ферредоксин

 

Бутиловый спирт — продукт брожения некоторых разновидностей маслянокислых бактерий — обнаружен Пастером в 1862 г. Несколько позднее Бейеринк выделил палочковидную бактерию, сбраживающую глицерин с образованием в числе продуктов брожения бутилового спирта. Более подробно вопросом образования при брожении бутанола занимались Фитц и Бухнер, а Шардингер (1905) установил, что некоторые бактерии при росте на средах с углеводами накапливают ацетон. Но все эти исследования сначала представляли чисто теоретический интерес. Положение, однако, изменилось в 1909 г., когда бутиловым спиртом заинтересовались как возможным исходным продуктом для синтеза каучука (через бутадиен). Первый ацетоно-бутиловый завод был построен в Англии в 1914 г. Брожение происходит с одновременным образованием трех продуктов: бутилового спирта, этилового спирта и ацетона.

В период первой мировой войны еще большее значение приобрел второй продукт брожения — ацетон, необходимый для приготовления взрывчатых веществ. Продукты брожения применяются для нужд нитроцеллюлозной и лакокрасочной промышленности, производства фотопленок, ацетилцеллюлозы, органического стекла и других отраслей химической и фармацевтической промышленности.

Несколько позже заводы по производству растворителей были построены в Канаде, США, Индии.

Создание в СССР производства бутилового спирта и ацетона путем брожения явилось результатом работ коллектива ученых, руководимого Шапошниковым. Проведенные ими исследования позволили в 1935 г. осуществить промышленное получение этих продуктов микробиологическим способом на специальном заводе.

1.4 Области применения

Ацетон  является популярным растворителем, значительно превосходящим в плане безопасности бензин, скипидар и отчасти керосин. В частности как растворитель используется он: в производстве лаков, в производстве взрывчатых веществ, в производстве лекарственных препаратов

Бутанол  используется как растворитель для красок, лаков и олиф, натуральных и синтетических смол, каучуков, растительных масел, красок и алкалоидов. Он играет роль промежуточного звена в производстве фармацевтических препаратов и химикалий, и используется в отраслях промышленности, производящих искусственную кожу, текстиль, небьющееся стекло, резиновый клей, шеллак, плащи, фотографические пленки и духи. Вторичный бутанол также используется как растворитель и химический промежуточный продукт; он входит в состав тормозных жидкостей, промышленных моющих средств, политур, средств для удаления краски, агентов для флотации руды, фруктовых эфирных масел, духов, красителей.

Масляная кислота (бутановая кислота, этилуксусная кислота) – применяют в качестве экстрагента щелочноземельных элементов (кальция, магния, бария), для обеззолевания (удаление солей кальция); в синтезе душистых веществ для парфюмерии пластификаторов, эмульгаторов и др.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ. УКАЗАТЬ, КАКИЕ ИЗ СУЩЕСТВУЮЩИХ МЕТОДОВ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ АЦЕТОНА, БУТАНОЛА, МАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ

В природе встречается множество микроорганизмов. Но в производстве для микробиологического получения различных веществ используют главным образом чистые культуры, т. е. однородные популяции микроорганизмов одного определенного вида и штамма. Чистую культуру обычно получают из одной изолированной клетки, которую потом постепенно размножают в стерильной среде. Эту работу проводят в стерильном боксе. Чистую культуру удобно изолировать, используя твердые среды Коха — агар, желатин и др. Если на поверхность твердой среды посеять достаточно разведенную суспензию микроорганизмов, то в благоприятных условиях вокруг каждой клетки культуры образуется островок однородных клеток — колония. Клетки из одной колонии при помощи петли или иглы в стерильных условиях переносят в стерильную среду, где они продолжают размножаться.

Для изолирования культур используют также метод Линднера. Согласно этому методу на покровное стекло кончиком пера наносят ряды капель культуры различного разведения и рассматривают в микроскоп каждую каплю. Каплю, где находится только одна клетка, с помощью кусочка стерильной фильтровальной бумаги переносят в стерильную среду. Отдельную клетку из препарата под микроскопом можно изолировать манипулятором.

Получая чистые культуры анаэробных микроорганизмов, работу проводят так, чтобы культура развивалась без доступа воздуха, например используют стеклянные трубочки — капилляры, пастеровские капиллярные пипетки и др. При выращивании микроорганизмов глубинным методом клетки суспендированы в жидкости и находятся во взвешенном состоянии. В небольшую (50 - 250 мл) колбу наливают жидкую питательную среду, в которую засевают чистую культуру либо с поверхности косого агара, либо из

ампул. Затем колбу на сутки или более помещают в термостат с определенной температурой, где культура растет и размножается. Чисто аэробные микроорганизмы выращивают в специальных колбах, которые ставят на качалку в термокамере. После этого культуру пересевают в лабораторные ферментаторы со средой такого же или несколько измененного состава. Лабораторные ферментаторы — стеклянные аппараты емкостью 1 -10 л, в которых можно обеспечить продувание среды воздухом, регуляцию температуры, рН и других условий роста. По описанной выше схеме обычно организуют исследование культур микроорганизмов. Кроме того, таким путем готовят и чистую культуру для производственных нужд. Дальнейшее размножение чистой культуры в производственных условиях идет в несколько стадий при использовании металлических инокуляторов объемом от 0,1 до 100 м3 и более. Инокуляторы снабжены мешалками, аэраторами, устройствами для стерилизации и охлаждения, арматурой, измерительными приборами. Для каждой следующей стадии необходимо 3 - 20% посевного материала (по объему).

Последнюю стадию, в которой получают нужный продукт, называют рабочей ферментацией. В культуральнои жидкости, полученной после нее, суспендированы микробная биомасса, остатки питательной среды и экстрацеллюлярные метаболиты. Методами химической технологии из культуральнои жидкости получают биомассу или нужное вещество — спирт, кислоту, аминокислоту, антибиотики и пр.

Аналогично выращиваются и анаэробные микроорганизмы только в этом случае через питательную среду не продувают воздух.

Используя метод поверхностных культур, микроорганизмы выращивают на твердых средах (влажные отруби и др.) или на жидких средах, залитых тонким слоем (2 - 20 см) в специальные кюветы. В этом случае биомасса располагается на поверхности среды. Чаще всего этим методом выращивают грибы, например культуры рода Aspergillus, используемые для получения лимонной кислоты и ферментов.  Сначала размножают споры, которыми инфицируют стерильную среду. В камерах с кюветами поддерживают нужную температуру и обеспечивают аэрацию — циркуляцию воздуха между кюветами.

Культивирование микроорганизмов может быть непрерывным и периодическим. При периодическом процессе весь объем питательной среды загружают в аппарат сразу, добавляют посевной материал и при оптимальных условиях продолжают процесс до тех пор, пока не накопится нужное количество биомассы или определенного метаболита. В ходе периодического культивирования изменяется темп роста культуры, ее морфология и физиология. За время культивирования меняется состав среды — уменьшается концентрация питательных веществ, увеличивается содержание метаболитов. С физиологической точки зрения периодическое культивирование невыгодно. В ходе его возникает также ряд технологических трудностей — циклический ход операций, сменные режимы, что затрудняет контроль и регуляцию процесса.

Указанные недостатки устраняются при непрерывном культивировании, методы которого разработали С. В. Лебедев, А. А. Андреев, Н. Д. Иерусалимский и другие ученые. Из непрерывных процессов лучше всего разработан метод глубинной ферментации. В этом случае в ферментатор с культурой продуцента непрерывным потоком подается стерильная среда, а из него непрерывно вытекает готовая культуральная жидкость. Процесс может быть гомо- и гетерогенно непрерывным. При гомогенно непрерывном процессе в аппарате, где идет интенсивное перемешивание, все параметры (концентрация питательных веществ, клеточный титр и др.) постоянны во времени. При гетерогенно непрерывном процессе несколько ферментаторов соединены вместе и образуют каскад.

Питательная среда поступает в первый ферментатор и готовая культуральная жидкость вытекает из последнего ферментатора. Культивирование микроорганизмов в протоке через систему трубок также идет по принципу гетерогенно непрерывного процесса ферментации. В этом случае имеет место непрерывный поток питательной среды, но клетки не обеспечены постоянными условиями роста (сколько аппаратов, столько и условий культивирования).

При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо отрегулировать такую скорость притока питательной среды и вытекания культуральной жидкости, чтобы предотвратить вымывание культуры из системы, т. е. концентрация клеток должна быть постоянной. В стерильных условиях непрерывный, или проточный, метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.

В промышленности ацетонобутиловое брожение ведут по непрерывному методу или полунепрерывному методу.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ АЦЕТОНА И БУТАНОЛА, ВКЛЮЧАЯ: ХАРАКТЕРИСТИКУ МИКРООРГАНИЗМОВ - ПРОДУЦЕНТОВ, ИСТОЧНИКОВ ПИТАНИЯ, ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПРОЦЕССА, АППАРАТУРНОЕ ОФОРМЛЕНИЕ

3.1 Особенности ацетоно-бутилового брожения

Бактерии, образующие в процессе своей жизнедеятельности в значительном количестве ацетон и бутиловый спирт, широко распространены в природе. Они находятся в основном в почве, откуда могут быть довольно легко выделены в виде чистых культур. Относятся к роду Clostridium, который включает большое число видов. Из различных клостридиев, способных к образованию в процессе брожения бутанола и ацетона, наиболее активным их продуцентом признан Clostridium acetobutyllcum, применяемый для производства этих растворителей.

Клетки С. acetobutylicum (рисунок 1) представляют собой палочки (0,6 - 0,9 х 2,4 - 4,7 мкм) с перитрихиальным жгутикованием. Образуют овальные споры, расположенные субтерминально.   Споры  выдерживают  нагревание  при   80°С   в  течение 10 - 30 мин, при 100°С — около 4 мин. Рост культур происходит только в анаэробных условиях на довольно простых средах, содержащих различные углеводы. Кроме углеводов С. acetobutyllcum может сбраживать глицерин, маннит, глюконат, пируват и некоторые другие вещества. Нуждается в таких витаминах, как биотин и парааминобензойная кислота. Бактерия способна к фиксации молекулярного азота. Оптимальная температура для роста 37 - 38°С, оптимальное значение рН среды 5,1 - 6,9.

Благодаря наличию амилолитических ферментов бактерия использует крахмал. Выделяет в среду протеиназы, в результате чего способна разлагать белки. Поэтому С. acetobutyUcutn относят к группе протеолитических клостридиев.

Сбраживание этой бактерией углеводов, как и другими клостридиями, происходит по фруктозобисфосфатному пути, т. е. по пути Эмбдена-Мейергрфа-Парнаса. Продуктами брожения являются уксусная и масляная кислоты, ацетон, бутанол, этанол, а также СО2 и Н2. Но состав продуктов и их количества в процессе брожения, а также в зависимости от условий, в которых оно происходит, может меняться.