Отъёмно–доливное культивирование микроорганизмов – продуцентов

 

Тема работы: «Отъёмно – доливное культивирование микроорганизмов – продуцентов»

1. Введение (Цель и задачи биотехнологии  как науки).

2. Общая характеристика различных  методов культивирования продуцентов.

3. Принципы составления питательных  сред. Основные источники питания, используемые для культивирования микроорганизмов–продуцентов. Методы оптимизации питательных сред.

4. Образование продуктов при  культивировании микроорганизмов. Первичные и вторичные метаболиты. Двухфазность процесса обмена  веществ у микроорганизмов.

5. Основные понятия об отъёмно–доливном  способе культивирования. Кинетические 

    характеристики, на основании  которых подбирается программа  проведения процесса.

6. Привести пример промышленного  применения отъёмно–доливного способа  ферментации и описать данный процесс.

7. Преимущества и недостатки  отъёмно–доливного процесса ферментации  по сравнению с традиционным  периодическим культивированием.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Содержание

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Биотехнология — междисциплинарная область научно-технического прогресса. Она весьма гетерогенна по своему теоретическому базису, потому что призвана исследовать не какой-либо класс объектов, а решать определенный круг комплексных проблем. Одной из них является, например, поиск дешевого заменителя тростникового (свекловичного) сахара, и армия биотехнологов берется за дело, сочетая в своей деятельности элементы различных наук: методы микробиологии, необходимые для выращивания микроорганизма, биохимии — для выделения глюкоизомеразы (дающей глюкозо-фруктозный сироп при использовании глюкозы как субстрата), органического синтеза— для получения полимерного носителя, а при регулировке параметров системы с иммобилизованным ферментом необходимы физико-химические расчеты. Добавим еще, что для повышения эффективности биосинтеза глюкоизомеразы могут быть использованы методы генетической и клеточной инженерии.

Круг вопросов, к решению которых привлекают биотехнологические разработки, весьма широк. Однако большинство из них прямо или косвенно связано с глобальными проблемами, стоящими перед современной цивилизацией: загрязнение окружающей среды, угроза экологического кризиса; истощение запасов полезных ископаемых, в первую очередь источников энергии, угроза мирового энергетического кризиса; нехватка продовольствия, особенно ощутимая в развивающихся странах.

Слова «биология» и «биотехнология» различаются лишь тем, что в слове «биотехнология» есть вставка «техно». И биология, и биотехнология имеют дело с живыми объектами, но как различны их подходы к живому! Биотехнолог изучает живое не из чисто познавательного интереса, он пытается «заставить» работать живые объекты, производить нужные человеку продукты. «Зачем  брать на  себя труд  изготовления  химических  соединений, если микроб может сделать это за нас?», — говорил Дж. Б. С. Холдейн еще в 1929 г., предвосхищая грядущий расцвет биотехнологии.

В современной биотехнологии живое рассматривается как средство производства в ряду всех прочих средств; например, при биологической трансформации органических соединений микроорганизмам отводят роль химических реагентов. Не случайна и стандартная для инженерной энзимологии метафора, уподобляющая иммобилизованные биообъекты «закованным в цепи рабам». Биообъект, таким образом, понижают в ранге, переводя из категории самостоятельной целостной живой системы в категорию реагентов, датчиков, реле, компьютерных деталей, прочих орудий модернизированного производства.

Эта тенденция современной биотехнологии имеет не только философское, но и практическое значение. Она порождает чересчур грубый, примитивный, чисто эмпирический подход к такому сложному объекту, как живое, что ведет к его низкоэффективному функционированию в условиях биотехнологического процесса. Не оправдал себя, в частности, лобовой метод оптимизации подобного процесса, оптимизация «грубой силой», проводимый без детальных знаний физиологии используемого организма. Недостаточно надежен в биотехнологии и метод кибернетического моделирования, упрощающий биологический объект до «черного ящика».

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕССА БРОЖЕНИЯ. ОСНОВНЫЕ ВИДЫ ПРОЦЕССОВ БРОЖЕНИЯ. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУКТОВ,ПОЛУЧАЕМЫХ ПУТЕМ АЦЕТОНО-БУТИЛОВОГО БРОЖЕНИЯ – АЦЕТОНА, БУТАНОЛА, МАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ. ХИМИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ ПЕРЕЧИСЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ

Брожение - процесс анаэробного расщепления органических веществ, преимущественно углеводов, происходящий под влиянием микроорганизмов или выделенных из них ферментов. В ходе брожения  в результате сопряженных окислительно-восстановительных реакций освобождается энергия, необходимая для жизнедеятельности микроорганизмов, и образуются химические соединения, которые микроорганизмы используют для биосинтеза аминокислот, белков, органических кислот, жиров и др. компонентов тела. Одновременно накапливаются конечные продукты брожения. В зависимости от их характера различают брожение спиртовое, молочнокислое, маслянокислое, пропионовокислое, ацетоно-бутиловое, ацетоно-этиловое и др. виды.  

1.1 Основные виды процессов брожения

Спиртовое брожение — это процесс окисления углеводов, в результате которого образуются этиловый спирт, углекислота и выделяется энергия. 

Сбраживание cахаров известно с глубокой древности. В течение столетий пивовары и виноделы использовали способность некоторых дрожжей вызывать спиртовое брожение, в результате которого сахара превращаются в спирт. 

Брожение производят главным образом дрожжи, а также некоторые бактерии и грибы. В различных странах для получения спирта используют различные микроорганизмы. Например, в Европе используют в основном дрожжи из рода Saccharomyces, в Южной Америке — бактерии Pseudomonas lindneri, в Азии — мукоровые грибы. 

Сбраживаться могут лишь углеводы, и притом весьма избирательно. Дрожжи сбраживают только некоторые 6-углеродные сахара.

Схематично спиртовое брожение может быть изображено уравнением  
С6Н12О6 -> 2С2Н5ОН + 2С02 + 23,5 • 104 дж. 

Процесс спиртового брожения — многоступенчатый, состоящий из цепи химических реакций. Превращения глюкозы до образования пировиноградной кислоты происходят так же, как и при дыхании. Эти реакции происходят без участия кислорода (анаэробно). Далее пути дыхания и брожения расходятся. 

При спиртовом брожении пировиноградная кислота превращается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Эти реакции протекают в две стадии. Сначала от пирувата отщепляется С02 и образуется уксусный альдегид; затем уксусный альдегид присоединяет водород, восстанавливаясь в этиловый спирт. Все реакции катализируются ферментами. В восстановлении альдегида участвует НАД-H2. 

Обычно при спиртовом брожении, кроме главных продуктов, образуются побочные. Они довольно разнообразны, но присутствуют в небольшом количестве: амиловый, бутиловый и другие спирты, смесь которых называется сивушным маслом — соединение, от которого зависит специфический аромат вина. Образование побочных веществ связано с тем, что превращение глюкозы частично идет другими путями. 

Биологический смысл спиртового брожения заключается в том, что образуется определенное количество энергии, которая запасается в форме АТФ, а затем расходуется на все жизненно необходимые процессы клетки.        

 

  1.1.1 Молочнокислое брожение

При молочнокислом брожении конечным продуктом является молочная кислота.  Молочнокислые бактерии подразделяют на 2 группы — гомоферментативные и гетероферментативные. Гомоферментативные бактерии (например, Lactobacillus delbrückii) расщепляют моносахариды с образованием двух молекул молочной кислоты в соответствии с суммарным уравнением:

C6H12O6 = 2CH3CHOH·COOH.        

 Гетероферментативные бактерии (например, Bacterium lactis aerogenes) ведут сбраживание с образованием молочной кислоты, уксусной кислоты, этилового спирта и CO2, а также образуют небольшое количество ароматических веществ — диацетила, эфиров и т.д.        

 При молочнокислом брожении. превращение углеводов, особенно  на первых этапах, близко к реакциям спиртового брожения, за исключением декарбоксилирования пировиноградной кислоты, которая восстанавливается до молочной кислоты за счёт водорода, получаемого от НАД-Н. Гомоферментативное молочнокислое брожение- используется для получения молочной кислоты, при изготовлении различных кислых молочных продуктов, хлеба и в силосовании кормов в сельском хозяйстве. Гетероферментативное молочнокислое брожение происходит при консервировании различных плодов и овощей путём квашения.

1.1.2 Маслянокислое брожение

Сбраживание углеводов с преимущественным образованием масляной кислоты производят многие анаэробные бактерии, относящиеся к роду Clostridium. Первые этапы расщепления углеводов при маслянокислом брожении аналогичны соответстветственным этапам спиртового брожения, вплоть до образования пировиноградной кислоты, из которой при маслянокислом брожении образуется ацетил-кофермент A (CH3CO-KoA).

Маслянокислое брожение применялось для получения масляной кислоты из крахмала.

1.1.3 Пропионовокислое брожение и пропионовокислые бактерии

Пропионовокислые бактерии обитают в рубце и кишечнике жвачных животных (коров, овец); они участвуют там в образовании жирных кислот, главным образом пропионовой и уксусной. Благодаря им образующаяся в рубце в результате различных видов брожения молочная кислота превращается главным образом в пропионовую. Пропионовокислые бактерии

не встречаются в молоке, и их не удается выделить из почвы или природных вод. Различают несколько видов таких бактерий, из которых наиболее известны вид Propionibacterium freudenreichii и его подвид shermanii, а также P. acidi-propionici (прежнее название -Р. pentosaceum). Возбудитель угрей - воспаления волосяных фолликулов у человека - тоже относится к пропионовокислым бактериям (P. acnes). Помимо рода Propionibacterium к бактериям, образующим пропионовую кислоту,  причисляют   Veillonella  alcalescens  (Micrococcus   lactilyticus), Clostridium propionicum, Selenomonas и Micromonospora. Пропионат как продукт брожения выделяют и многие другие бактерии.

Пропио-новая кислота образуется из молочной согласно следующему уравнению:

ЗСН3—СНОН—СООН   -> 2СН3—СН2—СООН   +   СН3— СООН   +   С02   +   Н20

Восстановление лактата или пирувата до пропионата идет по пути, который по характерному промежуточному продукту был назван ме-тилмалонил-СоА-путем. Сначала пируват при участии комплекса    биотин-С02    карбоксилируется    метилмалонил-СоА-карбокси трансферазой с образованием оксалоацетата, а затем восстанавливается через малат и фумарат до сукцината. Транспорт электронов на этом этапе сопряжен с фосфорилированием. Затем сукцинат с помощью СоА-трансферазы (сукцинил-СоА: пропионат-СоА-трансферазы) присоединяется к СоА и таким образом активируется. Сукцинил-СоА под действием метилмалонил-СоА-мутазы и при участии кофермента В12 (цианкобаламина) превращается в метил-малонил-СоА, и только от этого промежуточного продукта, наконец, отщепляется С02; в результате образуется пропионил-СоА, а С02 связывается с упомянутой выше метилмалонил-СоА-карбокситрансфе-разой. Из пропионил-СоА образуется пропионат, в результате того что СоА-трансфераза переносит СоА на сукцинат. Следует особо отметить, что в процессе образования пропионата две группы (С02 и СоА) переносятся с

последующего продукта на предшествующий, не освобождаясь. Заслуживает внимания и участие трех кофакторов (биотина, СоА и кофермента В12) в этом процессе. По метилмалонил-СоА-пути пропионат образуется у большинства пропионовокислых бактерий, а также у Veillonella alcalescens и Selenomonas ruminantium.

1.1.4 Ацетоно-бутиловое брожение

Бактерии Clostridium acetobutylicum сбраживают углеводы с преим. образованием бутилового спирта (CH3CH2CH2CH2OH) и ацетона (CH3COCH3). При этом образуются также в сравнительно небольших количествах водород, CO2, уксусная, масляная кислоты, этиловый спирт. Ацетоно-бутиловое брожение использовалось для промышленного получения бутилового спирта и ацетона, применяемых в химической и лакокрасочной промышленности.

1.2 Характеристика продуктов, получаемых путем ацетонобутилового брожения – ацетона бутанола, масляной кислоты

Масляная кислота (бутират)-продукт конденсации двух молекул ацетил-СоА при участии тиолазы с образованием ацетоацетил-СоА и его последующим восстановлением . Ацетоацетил-СоА восстанавливается за счет NADH2 при участии fi-гидроксибутирил-СоА-дегидрогеназы до (3-гидроксибутирил-СоА. От последнего с помощью крото-назы отщепляется вода. Кротонил-СоА под действием флавинового фермента бутирил-СоА-дегидрогеназы восстанавливается до бутирил-СоА. От бутирил-СоА с помощью СоА-трансферазы СоА может переноситься на ацетат; при этом освобождается масляная кислота, которая выходит в среду. Из ацетил-СоА при участии фосфотрансацетилазы и ацетаткиназы может быть получен свободный ацетат, что сопровождается синтезом АТР из ADP.