БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ПАНКРЕАТИТА

Рис. 3. Нормальный обмен уробилиногеновых тел (схема).

В клинической практике укоренился термин «уробилиноген мочи». Под этим термином следует понимать те производные билирубина (билирубиноиды), которые обнаруживаются в моче. Положительная реакцияна уробилиноген может быть обусловлена повышенным содержанием того или иного билирубиноида в моче и является, как правило, отражением патологии.

Определение в клинике  содержания в крови билирубина (общего, непрямого и прямого), а также уробилиногена мочиимеет важное значение при дифференциальной диагностике желтух различной этиологии,панкреатите (Химик ximik. ru).

5. Строение, биологическая роль α-амилазы и диагностическая ценность измерения активности амилазы в сыворотке крови при панкреотите.

Молекулярная масса очищенного фермента, выделенного из разных источников, имеет сходные значения — 50-52кД (КретовичВ.Л. 1986).

Амилаза(от (от лат. amylum - крахмал), ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз крахмала, гликогена и др. родственных олиго- и полисахаридов. Известны три типа амилаз: α-амилаз, β-амилаза и γ-амилаза (экзо—l,4-а-D-гликозидаза, или глюкоамилаза). Все эти три фермента гидролизуют крахмал, но существенно отличаются друг от друга. Важными критериями их классификации являются: способность гидролизовать α-1,4 - или α-1,6- гликозидные связи, экзо- или эндотип расщепления субстрата, образующиеся продукты ферментативного действия (Кретович В.Л. 1986).

α- и γ-Амилазы распространены в организме человека и животных. β-амилаза - в тканях высших растений. Некоторые авторы высказывают мысль, что γ-амилаза является ферментом "быстрого реагирования", она играет важную роль в тех случаях, когда в организме возникает необходимость в быстром образовании глюкозы из гликогена (ГромашевскаяЛ. Л., БогатырьТ. В., 1986г).

α-Амилаза (1,4-а-глюкан-гидролаза, КФ 3.2. l .1) гидролизует внутренние α-1,4-гликозидные связи (эндоамилаза) и ведет к образованию продуктов, сохраняющих способность давать с йодом окрашенные комплексы, мальтозы, мальтотриозы, незначительного количества глюкозы и неокрашиваемых йодом низкомолекулярных продуктов с разветвленной цепью, устойчивых к дальнейшему действию α-амилазы.

Амилолитическое расщепление полисахаридов в пищевом канале с помощью α-амилазы (слюны, ПЖ, слизистой оболочки кишок) является основным процессом превращения пищевых полисахаридов до низкомолекулярных углеводов, всасываемых кишечной стенкой. Внутриклеточная α-амилаза расщепляет гликоген до декстринов, служащих "затравкой" при синтезе гликогена при участии гликогенсинтетазы. Оптимум действия α-амилазы соответствует рН 6,8 — 7,2 и температуре 37ºС, при 55ºС наступает инактивация фермента (Фершт Э.,1980).

Содержание амилазы в крови одинаково для женщин и мужчин, не зависит от возраста. У новорожденных фермент обнаруживается лишь на 2-м или 3-м месяце жизни, достигает в течение первого года такой концентрации, которая сохраняется потом в течение всей жизнь (Мосс Д.В., Баттерворт П.Д. 1978).

Для проявления ферментативной активности и стабильности α-амилазы необходимо наличие ионов кальция и хлора.

Все виды α-амилазы - панкреатическая, солодовая, плесневая бактериальная и слюнная - содержат кальций, который необходим для поддержания вторичной и третичной структуры фермента. Опытным путем было установлено, что фермент, лишенный кальция, крайне неустойчив, чрезвычайно легко денатурируется и теряет активность в результате двухчасовой инкубации при рН, отклоняющемся от оптимального.

Таким образом, при оптимальном рН вторичная и третичная структура фермента поддерживается благодаря водородным и другим дополнительным связям; при более кислой и более щелочной реакции среды на первый план в качестве фактора, стабилизирующего структуру фермента, и, обеспечивая, таким образом, его каталитическую активность выступает кальций (Бернхард С. 1971).

Стабилизация структуры α-амилазы под влиянием кальция проявляется также в том, что фермент, лишенный кальция, очень легко расщепляется протеолитическими ферментами (Кретович В.Л.,1986). Для наглядности автор описывает проведенный эксперимент. В первом случае -амилазу обработали трипсином, во втором — этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА). Получили следующие результаты: трипсин практически не расщепляет α-амилазу, ЭДТА, связывая кальций, образует с ним прочное внутрикомплексное соединение (хелат). Однако, если α-амилаза предварительно обработана ЭДТА, то она быстро расщепляется трипсином. Таким образом, кальций в данном случае играет роль фактора, предохраняющего α-амилазу от расщепления протеолитическими ферментами.

Ион хлора в концентрации не ниже 10 мМ/л является аллостерическим активатором амилазы и необходим для оптимального действия фермента. Влияние хлорид-иона на α-амилазы животных тканей столь важно, что  и он рассматривается как естественный активатор данной группы ферментов. Другие одновалентные (но не двухвалентные) анионы также оказывают некоторое влияние на активность α-амилаз, причем параллельно изменяются и физические свойства чистого фермента, например растворимость и электрофоретическая подвижность (Диксон М. Уэбб Э. 1982).

Для функционирования α-амилаз необходим также ион Сu+² однако не ясно, участвует ли он в катализе или же в поддержании надлежащей конформации фермента(Фершт Э. l980).

Существуют противоречивые данные о стабильности α-амилазы: наряду с утверждением, что активность фермента стабильна при комнатной температуре в течение недели, а при 4º С или при - 20º С в течение месяца, имеются данные о том, что активность фермента снижается уже через несколько часов хранения как при комнатной температуре, так и при 4º С (Творогова М.Г.,и др., 1989).

Предполагают, что активный центр α-амилазы имеет пять подцентров, взаимодействующих с остатками глюкозы; каталитический центр локализован между подцентрами 2 и 3. В случае пентасахаридного субстрата образуется только один фермент-субстратный комплекс, и первичная атака осуществляется исключительно по связи между 2 и 3 остатками сахара. С другими субстратами может образовывать ряд комплексов; при этом гидролизуется несколько связей, однако, с различными скоростями (Диксон М. Уэбб  Э.1982).

На основании ряда исследований с различными амилазами (Фершт, 1980; Диксон, Уэбб, 1982), высказано предположение о возможности множественной атаки субстрата, когда в течение жизни одного фермент субстратного комплекса гидролизуется несколько связей; при этом имеется высокая вероятность гидролиза связи, находящейся поблизости от только что прогидролизованной. В предельном случае ("атака одиночной цепи") фермент полностью гидролизует одну молекулу субстрата, прежде чем начинает гидролизовать другую. Выраженность феномена множественной атаки, по-видимому, изменяется в зависимости от экспериментальных условий; так в случае действия панкреатической амилазы при рН 10,5 после образования фермент-субстратного комплекса гидролизуется одна связь, в то время как при рН 6,9 наблюдается выраженная множественная атака, перемещающаяся от первоначально атакуемой связи в направлении нередуцирующего конца.

α-Амилаза обнаружена во всех тканях животных, но основными местами ее синтеза являются поджелудочная и слюнные железы. Установлено, что эти две формы α-амилазы, обозначаемые в литературе АС, S (амилаза слюнных желез) и АП, Р (амилаза поджелудочной железы) генетически детерминированы, т.е. являются истинными изоферментами. Структуру этих двух форм определяют две пары неаллельных аутосомных генов (соответственно АМУ 1 и АМУ 2), которые и ответственны за их биосинтез. Они локализованы в 1-й паре хромосом человека (Диксон М., Уэбб Э., 1982).

α-Амилазы различного происхождения сильно различаются по содержанию в них целого ряда аминокислот (Кретович, 1986). Эти отличия в аминокислотном составе приводят к тому, что αамилазы этих двух форм значительно различаются по некоторым свойствам, например, по поведению при электрофорезе, по термостабильности. Каждая из этих двух форм амилазы при электрофорезе разделяется на несколько фракций. Г.С.Кесесалу в поджелудочной железе обнаружены 4 фракции α-амилазы, в слюне - 5 фракций, в тонкой кишке-5. Другие авторы обнаруживали большее или меньшее количество фракций (Громашевская, Богатырь, 1986).

В сыворотке крови может встречаться амилаза в виде крупных комплексов - макроамилаза. К настоящему времени получено много данных о природе комплекса макроамилазы могут принимать участие все три класса иммуноглобулинов (А,G,М). Комплексование с иммуноглобулинам и происходит подобно реакции между антигеном и антителом. Комплексы амилазы могут частично или полностью диссоциировать до амилазы с нормальной молекулярной массой. Наличие макроамилазы в сыворотке крови может быть обнаружено с помощью хроматографии, ультрацентрифугирования, электрофореза. Макроамилаземия обнаружена при остром панкреатите, заболеваниях печени и желчных путей, сахарном диабете, почечной недостаточности, а также - при алкоголизме, нарушении процессов всасывания в кишечнике, аутоиммунных процессах (Мосс, Баттерворт, 1978; Громашевская, Богатырь, 1986). Она описана у больных с карциномой легких, поджелудочной железы, желудка, пищевода, при лейкозах. Макроамилаза обнаружена в плевральной жидкости у больного лимфомой и в амниотической жидкости (B rock, 1987).

Определение изоферментов α-амилазы имеет существенное значение для диагностики патологий ПЖ. При ОП наблюдается повышение активности панкреатического изофермента, а при хроническом панкреатите отмечается его резкое снижение или отсутствие.

Многие авторы убеждены, что исследование изоферментов α-амилазы более информативно для диагностики болезней ПЖ, чем исследование общей активности α-амилазы (Громашевская, Богатырь, 1986; Кадашева и др., 1991; Битти, 1995; Циммерман, Зуева, 1997; Кокцева и др., 2001). По мнению этих авторов, измерение изоферментов в моче весьма целесообразно при диагностике хронического панкреатита, ими подчеркивается особое значение определения панкреатического изофермента в тех случаях, когда диагностируют панкреатит на фоне нормальной общей активности амилазы. Так, исследования Skuede и Eriksson (1976) показали, что уровень панкреатической изоамилазы в сыворотке при хроническом панкреатите существенно снижен по сравнению с контролем, хотя содержание общей сывороточной амилазы у таких больных остается в пределах нормы. Но несмотря на эти данные, уровень сывороточной и мочевой амилазы продолжает считаться маркером только острого панкреатита (Битти, 1995).

Появление в крови высоких концентраций панкреатической амилазы при ОП является основой для применения ферментативных тестов в целях наиболее раннего обнаружения поражения органа. Гроздевидные клетки ПЖ становятся проницаемыми для ферментов в результате возникновения воспаления в совокупности с воздействием повышенного давления, характерного для закупорки панкреатического протока. Последнее подтверждается наблюдениями, согласно которым морфин, сокращающий сфинктер Одди, вызывает увеличение амилазной активности в сыворотке (Мосс, Баттерворт, 1978). Гиперамилаземия наступает уже через несколько часов (4 - 6 ч) после начала острого приступа панкреатита, достигая через 12 - 24 ч уровней, в 5 - 10 и даже в 10 - 30 раз превышающих нормальное значение. Активность амилазы затем резко снижается, возвращаясь к нормальному уровню на 2 - 6 день (Костюченко, Филин, 2000). Это связано либо с тем, что клетки вновь становятся непроницаемыми для фермента, либо в отдельных случаях со снижением синтеза амилазы в ПЖ (Филлипс, Чадвик, 1985).

Амилаза - один из немногих ферментов с молекулярной массой. достаточно низкой для того, чтобы он мог попасть в мочу, и поэтому его обнаруживают в моче, собранной в течение приступа и сразу же после него при условии нормального функционирования почек (Мосс, Баттерворт, 1978). Более точную информацию получают при исследовании активности амилазы в суточном объеме мочи. Важное, а в ряде случаев и решающее значение для распознавания рецидивирующей формы ОП имеет повторное повышение активности амилазы крови и мочи во время повторяющихся рецидивов болевого синдрома. Поэтому проводят повторный анализ по определению активности амилазы мочи на протяжении первых двух суток заболевания (Костюченко, Филин, 2000).

Многие авторы считают измерение активности сывороточной амилазы ценным методом при исследовании острой абдоминальной боли и наиболее употребимым тестом диагностики острого панкреатита (Мосс Баттерворт, 1978, Лукьянов, 1989; Творогова и др., 1989; Чернов и др., 1997; Харченко и др., 2000; Кокцева и др.,2001).

Активность α-амилазы для диагностических целей измеряют на протяжении более 100 лет, и до настоящего времени, таким образом, этот метод не утратил своего значения.

Однако многие авторы для повышения информативности рекомендуют определение активности амилазы крови и мочи сочетать с другими методами диагностики, указывая на то, что активность α-амилазы сыворотки является хотя и важным, но не специфическим показателем для ОП (Кадашева и др., 1991; Вашетко и др., 2000; Костюченко, Филин, 2000).

Следует помнить, что другие абдоминальные нарушения, такие, как прободная язва желудка или кишечная непроходимость, могут вызывать увеличение сывороточной активности амилазы путем вторичного поражения ПЖ, однако эти сдвиги обычно небольшие. В кровь амилаза может также попадать при паротите, но маловероятно, что эти состояния представляют отдельную диагностическую проблему (Мосс, Баттерворт, 1978). Увеличение активности амилазы в крови возможно за счет ее реабсорбции из области селезенки при перитонитах, тромбозе мезентериальных сосудов, при разрыве маточной трубы в случие внематочной беременности, а также после введения морфина, кодеина, адренокортикотропного гормона (АКТГ), кортизона. Амилаза, поступающая в кровяное русло, выводится дольками, увеличивая тем самым количество фермента в моче (Капитаненко,Дочкин, 1988).

Метод Benda в модификации В.В.Желтвая (1985) предусматривает определение не только концентрации фермента и α-амилазы в утренней моче, но и его количества за три 30-минутных интервала: натощак (после предварительного опорожнения мочевого пузыря) и через 30 и 60 минут после стандартной пищевой нагрузки (например, завтрак Лунда). Прием пищи должен вызывать "высвобождение" из слизистой оболочки ДПК эндогенного гормона панкреазимина, а последний - стимулировать выделение панкреатических ферментов, в том числе α-амилазы, увеличивая одновременно и ее мочевую эскрецию.