Производство пива: стадия солодоращения

 

 

    Фосфатазы  катализируют гидролитические расщепление фосфорнокислых

эфиров, причем различают два их типа: щелочные фосфатазы с оптимальным значением pH  около 8,4-10,5, и кислые фосфатазы, подразделяемые на три различные группы (в тканях зеленых растений встречается только кислая «фосфатаза 1»). Фосфатаза уже имеется в ячмене, находящемся в состоянии покоя, и при дополнительном образовании фермента в алейроновом слое ее количество повышается в 5-6 раз. Даже если при замачивании и сушке наблюдается заметное снижение активности фермента, активность фосфатаз солода все равно примерно в 3 раза выше активности фосфатаз ячменя. Проявление активности фосфатаз в ходе проращивания зависит от места возделывания ячменя и особенностей года.

К эстеразам также относят фермент β-глюкансолюбилазу, высвобождающую в соединениях гемицеллюлоз с протеинами высокомолекулярный β-глюкан. β-Глюкансолюбилаза уже присутствует в зерне, находящемся в состоянии покоя, и при проращивании ее активность возрастает в 5 раз. Потери этого фермента при сушке незначительны.

При высвобождении гемицеллюлоз из соединений с белками действуют следующие эстеразы: ферулоэстераза и неспецифическая эстераза. Ферулоэстераза расщепляет эфирные связи между феруловой кислотой и арабинозой, а неспецифичная эстераза делает пентозаны растворимыми. Можно отметить, что эта ферментативная активность не вызывает роста микроорганизмов на поверхности зерна.

2.2.2Карбогидразы

К карбогидразам относят ряд ферментов, расщепляющих крахмал, гемицеллюлозу и целлюлозу. К ферментам, расщепляющим крахмал, относят α- и β-амилазу, а также ряд олигосахаридаз.

Крахмал содержится в клетках в виде крупных и мелких зерен, окруженных мембранами. Последние склеены друг с другом белком, поскольку поверхность зерен крахмала богата протеинами. В связи с этим расщеплению крахмала должно предшествовать расщепление белков и гемицеллюлоз клеточных стенок протеолитическими ферментами. Расщепление крахмала при солодоращении ограничено. Часть продуктов расщепления крахмала используется в зародыше листа или корешка для формирования новых тканей. При расщеплении крахмала гидролизуется лишь около 18%, а оставшийся крахмал меняется только структурно. Так, часть мелких крахмальных зерен расщепляется во время солодоращения, крупные же зерна лишь слегка поверхностно повреждаются. Длина внешних цепочек амилопектина сокращается, в результате чего соотношение связей α-1,4 и   α-1,6 меняется в пользу последних. В результате преимущественного расщепления амилопектина в крупных зернах доля амилозной части крахмала возрастает с 25 до 29%.

  α-Амилаза действует как эндофермент и гидролизует в макромолекуле амилозы внутренние связи α-1,4. С использованием иммуноэлектрофореза

 

 

обнаруживаются два компонента α-амилазы (изоферменты). α-Амилаза-I обусловливает лишь 5% общей активности и расщепляет крупные зерна крахмала (> 15 мкм) быстрее, чем α-амилаза-II, активность которой составляет 95% от общей активности. При этом сразу образуются олигосахариды, состоящие из 6-7 глюкозных остатков (низкомолекулярные декстрины), которые при более длительном воздействии фермента на субстрат расщепляются на мальтозу, глюкозу, мальтотриозу и небольшое количество низкомолекулярных декстринов.

Макромолекула амилопектина подвергается воздействию α-амилазы на участках между разветвлениями также по связи α-1,4. Наряду с линейными декстринами образуются декстрины с изомальтозными связями α-1,6. При более длительном воздействии фермента «осколки» продолжают расщепляться, и поэтому в качестве конечных продуктов могут оказаться глюкоза, мальтоза и изомальтоза. Под действием α-амилазы вязкость крахмального клейстера быстро снижается с исчезновением характерного синего окрашивания с йодом. Условия действия α-амилазы представлены в таблице 2.

Таблица 2- Оптимальные условия функционирования α-амилазы

                            В чистых крахмальных растворах   В заторе(некипяченом)

Оптимум pH                                         5,6-5,8                                5,6-5,8

Оптимум температуры, °С                   60-65                                  70-75

Температура инактивации, °С                70                                       80

 

Ионы Са2+, Zn2+, С1-,  повышают, а сульфат железа, сульфат и нитрат хрома, сульфаты цинка и меди понижают активность α-амилазы. Молекулярная масса α-амилазы 45 000-47 000. В непроросшем ячменном зерне α-амилаза присутствует в латентной (скрытой) форме — ее активность впервые становится заметной при проращивании, причем в ростке образуется вещество, подобное гибберелловой кислоте, которое индуцирует образование в алейроновом слое гидролитических ферментов. При отсутствии живого зародыша α-амилаза в алейроновом слое не образуется. При введении же гибберелловой кислоты извне механизм образования ферментов может действовать и без живого зародыша. Тормозить образование амилазы могут моно- и дисахариды. Кроме того, на образование α-амилазы в ходе проращивания существенно влияют сорт ячменя и условия солодоращения; заметные потери фермента наблюдаются при сушке. Погодные условия в вегетационный период влияют на образование и накопление α-амилазы — так, в ячмене, выросшем в холодное лето, содержится больше α-амилазы, чем в выросшем в жарких и сухих условиях.

Среди условий проращивания решающее значение имеет влажность зерна — чем она выше, тем выше α-амилазная активность. При высокой степени замачивания следует учитывать водочувствительность ячменя.  Возрастание влажности проращиваемого материала с 43 до 46% вызывает резкое увеличение активности фермента. Ее можно увеличить и больше, если доводить влажность до максимальной величины лишь после равномерного прорастания, рисунок 2.

 

Активность α-амилазы, ед. ASBC

                                Продолжительность замачивания, сут

Влажность ячменя 40%  

Влажность ячменя 43%  

Влажность ячменя 46%  

Рисунок 2-Влияние степени замачивания на активность α-амилазы

 

На образование α-амилазы влияет также продолжительность проращивания, причем влажность зерна здесь выступает регулирующим фактором.

Повышенная температура проращивания способствует более быстрому первоначальному образованию α-амилазы, однако затем ее образование замедляется, что, возможно, связано с более быстрым накоплением продуктов гидролиза крахмала, чем при более холодном проращивании:

 

Температура проращивания, °С                   13                       17                   17/13

 α-Амилазная активность, ед. ASBC            68,5                    62,5                 76,5

Результаты солодоращения, проводимого при снижении температуры с 17 до 13 °С, превосходят результаты, получаемые при постоянных температурах (13 или 17 °С).

Основное значение для вновь образуемого фермента, например α-амилазы, имеет содержание кислорода в воздухе над прорастающим зерном. При добавлении 10 или 20% С02 образование α-амилазы замедляется, рисунок 3.

 

α-Амилаза

                                          Продолжительность проращивания, сут

Рисунок 3-Образование α-амилазы при различном содержании С02

 

β-Амилаза представляет собой экзофермент, гидролизующий амилозу с нередуцируюшего конца, отщепляя молекулу мальтозы. В результате расщепления сразу получается мальтоза — йодная реакция начинает ослабевать лишь позднее, когда амилозная цепочка сократится до 9 глюкозных остатков.

Из-за линейного соединения остатков глюкозы амилоза полностью расщепляется до мальтозы. Если же субстрат имеет ветвление, то три последних перед ветвлением остатка глюкозы остаются в виде мальтотриозы или очень медленно гидролизуются до мальтозы и глюкозы. Амилопектин также гидролизуется с нередуцируюшего конца боковых цепочек и расщепляется до мальтозы. Действие β-амилазы прекращается за 2-3 глюкозных остатка до места ветвления. Результатом этого расщепления являются 50% мальтозы и так называемого предельного β-декстрина, дающего с йодом красное окрашивание. Дальнейшее расщепление происходит лишь тогда, когда в реакцию вступает α-амилаза и разрушение внутренних связей создает новую возможность для расщепления β-амилазой.

Условия действия β-амилазы представлены в таблице 3.

 

Таблица 3- Оптимальные условия функционирования β –амилазы

 

                            В чистых крахмальных растворах   В заторе(некипяченом)

Оптимум pH                                             4,6                                  5,4-5,6

Оптимум температуры, °С                   40-50                                 60-65

Температура инактивации, °С                60                                      70

 

Действие β-амилазы ингибируют ионы тяжелых металлов (Сu2+, Hg2+), галогены и озон. Молекулярная масса фермента 54 000. В ячменном зерне β-амилаза находится в активной и латентной (связанной) формах

Наивысшая активность β-амилазы наблюдается в алейроновом слое, а к центру зерна она уменьшается. С помощью электрофореза выявлено 7 компонентов β-амилазы, а это означает, что она существует и в форме изоферментов.

Активность свободной β-амилазы в ячменном зерне, находящемся в состоянии покоя, зависит от сорта ячменя и содержания в нем белка.

Повлиять на процесс высвобождения активной β-амилазы во время солодоращения можно разными способами. При использовании нескольких водных замачиваний активность β-амилазы слегка убывает, а при замачивании с воздушными паузами активная β-амилаза накапливается в основном во время второй воздушной паузы, длящейся около 20 ч, то есть в фазе прорастания, рисунок 4.

При повышении исходной влажности проращиваемого материала отмечается усиленная активация фермента. Замечено, что повышение влажности свыше 43% не дает существенного эффекта — наибольший рост активности наблюдается на 2-5-е сутки, и в дальнейшем происходят незначительные ее изменения. Проращивание при влажности 40% или при максимальной влажности 46% не дает заметных преимуществ.

 

 

 

Количество мальтозы, мг/100г CB

                                               Продолжительность проращивания, сут

Влажность ячменя 40%  

Влажность ячменя 43%  

Влажность ячменя 46%  

 

Рисунок 4-Зависимость содержания β-амилазы (по мальтозе) от степени замачивания    ячменя

 

Температура проращивания по имеющимся данным оказывает меньшее влияние, чем влажность материала. Данные для высушенного солода:

Температура проращивания, °С                   13                       15                      17

Активность β-амилазы, °WK                       251                    263                     230

При более высоких температурах прорастания наблюдается меньшая    

β-амилазная активность, соответствующая меньшей степени растворимости белков. При температурах проращивания, которые после фазы прорастания и достижения максимальной влажности снижаются с 17-18 до 12-13 °С, в отличие от обычного режима(влажность 46%, постоянная температура 15°С).

В целом влияние технологических режимов проращивания на активность

β-амилазы сравнительно невелико.

Мальтаза расщепляет мальтозу на две молекулы глюкозы. В ячменном зерне мальтаза присутствует в связанном виде и при проращивании значительно активируется.

Предельная декстриназа гидролизует α-1,6 связь, но только в случае, если на каждой стороне этой связи имеется как минимум по одному остатку глюкозы, соединенному α-1,4-связью с остатками, образующими α-1,6-связь.

Этот фермент может присутствовать в свободной и связанной формах. Во время сушки инактивируется около 40% обеих форм фермента. Предельная декстриназа в зерне, находящемся и состоянии покоя, содержится в связанной форме (свободная форма не обнаруживается). Общая активность невелика и находится и пределах 100-150 ед./кг. Как свободная, так и общая активность стремительно возрастает после 4-х суток замачивания и достигает своего максимума через 8-10 суток. Развитие свободной формы предельной декстриназы зависит от сорта ячменя и может достигать 7-48% общей активности декстриназы. При увеличении содержания свободного фермента связанная или латентная активность предельной декстриназы снижается на 6-е сутки. Образование предельной декстриназы и α-глюкозидазы показано в таблице 4.

Таблица 4- Образование предельной декстриназы и α-глюкозидазы

  Показатель                 Предельная декстриназа    α-глюкозидазы  α-амилазная активность

                                               рост E 1см/600              рост E 1см/600       E/мг белка

                                                на 1 мг белка                  на 1 мг белка

У исходного ячменя                0,09                                   0,47                             0,12

После замачивания                  0,07                                   0,92                             0,18

в течение 3 сут

После проращивания              0,28                                   1,06                              7,8

в течение 36 ч

После проращивания              0,96                                   1,04                              9,34

в течение 84 ч 

После проращивания               1,49                                  1,14                             13,67