Азотобактер туысы бактерияларының фитопатогенді саңырауқұлақтарға қатысты антогонистік белсенділігі бар штамдарды сұрыптау

 

2.3.1 Протеолитикалық, амилолитикалық қабілеттерін анықтау әдістері

1. Амилолитикалық белсенділік.

Крахмал гидролизі. Крахмал гидролизін микроорганизмдер жүргізеді, амилазаны түзіп крахмал  гидролизінің өнімдерін көміртек көзі және энергиия ретінде пайдаланады (%): пептон-1,0, KH₂PO₄  -0,5, еріген крахмал-0,2, агар-агар-1,5, ортаның pH-6,8-7,0. Аталған компоненттерден 40мл орта жасап, оны 1 атм залалсыздандырады, содан соң оны залалсызданған петри табақшасына құйып, орта қатқан соң штрих әдісімен егеді. Дақылдау ұзақтығы 7-10 тәулік аралығы.

Крахмалдың  гидролизін байқау үшін  қоректік ортадағы штрихтің айналасының түссізденуінен біледі. Гидролиздің анық көрінуі  үшін агарлы ортаны Люголь ерітіндісімен  өңдейді. Йод-крахмалға индикатор, ол кезде барлық қоректік орта көк түске боялады.

2. Протеолитикалық белсенділік.

Желатиннің  ыдырауы. Желатинді ыдырататын белсенді микроорганизмдер қоректік ортаға протеолитикалық  ферменттерді(коллагеназаларды) бөледі. Бұл белсенділікті бөліп алу  үшін зерттелетін организмді ет-пептонды желатинге (ЕПЖ) егеді, ол орта келесідей ретпен дайындалады: ЕПС-ға (ет-пептонды сорпа) 10-15% желатинді қосады, содан  соң оны 30 минут қойып қояды, яғни желатин ісіну үшін одан әрі өоспаны су моншасында желатин толық ерігенге дейін қыздырады, алынған ЕПЖ–ді пробиркаларға 5-6мл етіп құяды. 0,5 атмосферада 15 минут залалсыздандырады. Егуді укол әдісімен жүргізеді. Дақылдау ұзақтығы 7-10 тәулік, бөлме температурасында ұстайды.

Желатиннің  ыдырауын немесе оның мүлде болмауын визуальді анықтайды. Егер желатин  ыдыраса, интенсивтілігін және ыдырау формасын қапшық тәріздес, көпіршікті және де көп түрлері кездеседі. Микроорганизмдердің  физиологиялық-биохимиялық қасиеттерін анықтаудағы ең көңіл аударатын әдістердің біріне желатинді ыдырату жатады [64].

 

2.3.2 Идентификация әдісіне белсенділік 

 

2.3.3 Бактерияларды бояусыз Грам әдісі бойынша ажырату

Бактерияларды грам теріс және грам оң етіп бояу үшін, осы екі топ бактериылардың клетка қабырғасындағы химиялық құрамының ерекшеліктеріне байланысты оларды Грм әдісімен бояу арқылы анықтайды. Әдетте Грам әдісімен бояу барлық микробиологиялық әдістерде қолданылады, бірақ дифференциациялау үшін жылдам және оңай жасалатын жолы-ол бояусыз Грам әдісі.

1 – 2 тәуліктік клетка культураларын тұзақ көмегімен заттық шыны бетіндегі 3 % - тік КОН тамшысына орналастырып шеңберлі қозғалыс көмегімен араластырып, 5 – 8 с кейін бірден көтеріп қалады. Грам теріс бактериялар суспензиялары тұтқыр, созылмалы түрде болып, тұзақтан тез арада алына қоймайды, олар мукойдты ауырлықты түзеді. Грам оң бактариялар сілті тамшысында (судағыдай) біркелкі жайылады [37]. Егер 60 секунд аралығында шырыш түзілмесе, онда реакция теріс болып шығады. Тұтқырлықтың көбеюі грам теріс бактериялардың клетка қабырғасының сілтілі ортада лизиске ұшырауынан және ДНҚ-ның бөлініп шығуынан болатын құбылыс.

2.3.4 Оксидазаға белсенділік

1-әдіс. Фильтр қағазының жартысына сол күні дайындалған 1%-тік дегидрохлорид тетраметрил-n-фенилендиамин ерітіндісімен бірнеше тамшы тамызады. Өскен дақылды агарлы ортаның жоғарғы жағынан платинді тұзақпен (әдетте тұзақ нихромды болса, ол тәжірибе барысында реакцияны жалған, дұрыс шығармауы мүмкін) алады, одан әрі қарай оны жұмсартылған қағазға жағады. Егер реакция оң болса, онда 10 секундтың ішінде күлгін түске боялуынан болады. Оң нәтиже Ps.aeruginosa, ал теріс нәтиже - E.coli болып шығады.

2-әдіс. Бұл  әдістің сезімталдылығы аз және  өте ыңғайлы. 1%-тік Ь-нафтол ерітіндісінен, еріген 95%-тік этанол ерітіндісінен және жаңадан дайындалған 1%-тік диметил-n-фенилендиаминнің сулы ерітіндісінен (1:1 қатынаста) қосады. Басқаша нұсқада дақылға Ь-нафтолдан 0,2 мл және диметилпарафенилендиаминнен 0,3 мл қосып, оны жақсылап араластырады. Оң реакция колониялардың немесе споралы дақылдардың қанық күлгін түске 10-30 секунд аралығында боялуы.

2.3.5 Каталазаға белсенділік

      Каталаза активтілігін анықтауға арналған тест – пробиркада ет – пептонды агарға егу жүргізеді. Инкубациядан кейін қиғаштан төмен бойынша 1 мл 3 % - тік сутегі асқын тотығын құяды. Бірден 5 минуттан кейін   көпіршіктердің түзілуін байқайды, ол оң реакцияны түсіндіреді. Бір уақытта бірнеше тамшы 3 % - тік сутегі асқын тотығын табақшадағы қарқынды өсу аймағына  құяды. Бульонды культура болған жағдайда 0,5 мл культураға 0,5 мл 3 % - тік сутегі асқын тотығын құяды және әрдайым көпіршіктердің түзілгенін байқайды. Кейбір бактериялар,мысалы сүт қышқылды бактериялар глюкоза концентрациясы өте төмен немесе мүлдем глюкозасы жоқ  орталарда псевдокаталазаны түсіндіреді. Псевдокаталазаның түзілуін болдырмау үшін ортаға 1%-тік глюкозаны қосады. Анаэробтарды каталазалық белсенділікке тексеру үшін сутегінің асқын тотығын қоспас бұрын дақылды ауада 30 минут ұстаған дұрыс. Оң нәтиже - St.epidermidis, теріс нәтиже - Streptoccocus lactis.

2.3.6 Липазаға белсенділік

1- әдіс. Жұмыртқаның сары уызы қосылған агарлы петри табақшасына штрих әдісімен егуді жүргізеді. Жұмыртқаның сары уызы қосылған агар қоректік ортасы (г\л): пептон-20, Na₂HPO₄-2,5, NaCl-1, глюкоза-1, агар-12,5, MgSO₄ 0,5%-тік ерітіндісінен-1мл, дистилденген су- 500 мл. Осы компоненттерді араластырады, ортаның рН 7,3-7,4-ке дейін жетеді. Қоспаны агар ерігенге дейін қыздырады, автоклвта 0,5 атм залалсыздандырып, оны 60⁰С-дейін салқындатады. Жұмыртқаның сыртын жақсылап спиртпен дезинфицирлейді және оны бос қойып қояды, кепкенше. Содан соң жұмыртқаны жарып, саруызын белоктан ажыратады. Асептикалық барлық жағдайларды қатаң сақтай отырып жұмыртқа сарысын еріген агарға қосып, оны біртекті суспензия болғанша жақсылап араластырамыз. Осы қоспаны петри табақшаларына құямыз. Инкубациядан соң табақшаның бетін ашып, жоғары жағын жай қарап, бақылайды. Оң нәтиже – майлы, жылтыр немесе агардың жоғары жағында байқалады. Оң нәтижеге мысал- Clostridium sporogenes, теріс нәтижеге - Clostridium butyricum.

2-әдіс. Бұл әдісті эфирлер, яғни пальмитинді, стеаринді және олейн қышқылдары үшін қолданады. Әдісті жасау үшін (мысалы,  МПА) агарлы қоректік орталарды 0,01% CaCl₂ қосу арқылы сол ортаны пайдаланады. Твин-40 (пальмитинді қышқылының эфирі) 1 атм залалсыздандырады. Стерильді твинді еріген агарлы қоректік ортаға қосады, 45-50⁰C-та ұстап, концентрациясы 1% жеткенше қарайды. қоректік ортаны твин толығымен ерігенше қыздырып, петри табақшаларына құйып, қатқан агарлы ортаға дақылды штрих әдісімен егеді. Оң нәтиже – колонияның айналасында тұнық түр пайда болады- Ps.aeruginosa, теріс нәтиже-Ps.putida.

2.3.7 Диастазаға белсенділік 

Диастаза  ферментінің  (амилазаның) крахмалды ыдыратуын байқау үшін арнайы крахмал- аммиакты (КАА) агарлы қоректік орта пайдаланылады.  Онда ерімеген крахмалды Люголь ерітіндісінің көмегімен анықтайды. Культуралар өскен табақшаларға Люголь ерітіндісін құяды. Колония айналасындағы зона қызыл қоңыр түске боялады (гидролиз декстрин сатысына дейін жеткен), не олар түссіз болып қалады (гидролиз қантттар сатысына дейін жеткен). Крахмал болатын ортада глюкоза болмауы керек себебі, оның қатысында крахмал гидролизі ингибирленеді. (+) мысал- Bacillus  subtilis, теріс нәтиже Bacillus maceran [65].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 АЛЫНҒАН НӘТИЖЕЛЕР МЕН ОЛАРДЫ ТАЛДАУ

 

3.1 Әртүрлі топырақтан Azotobacter туысына жататын бактерияларды бөліп алу

Биологиялық препараттарды қолдану алдында  оның шығу тегін біліп алу өте  қажет. Кейбір биологиялық препараттар  басқа географиялық аймақтан алынған  штаммдар болғандықтан антагонистік қасиетін басқа климаттық аймақтарда қолданғанда  жойылып кетеді. Сондықтанда, еліміздің  климаттық аймақтарын есепке ала  отырып бипрепарат жасауға арналған пайдалы микроорганизмдерді бөліп  алу және олардың түрлі қасиеттерін  зерттей отырып сұрыптау маңызды  болып табылады.

Ол үшін ең алдымен топырақ үлігілерінде азот тұтушы бактериялардың кездесу  мөлшерін екі түрлі әдісті (он еселік сұйылты әдісі, топырақ түйіршікті әдісі және топырақ пластинкасы  әдісі) қолдана отырып анықтадық.

Зерттеу жұмыстарымызды ең алдымен әртүрлі  топырақ үлгілеріндегі азоттұтушы бактерияларды кездесу мөлшерін топырақ түйіршікті әдісімен пайыздық көрсеткіш бойынша анықтадық.  

Сонымен Атырау облысының топырақ үлгілерінде  азоттұтушы бактериялардың мөлшері  маннит қосылған ортада 10-20 см тереңдікте 61,2 % болса, сахароза қосылған Эшби ортасында 98,3 % болды. Ақмола облысы топырақ үлгілерінде 10-20 см тереңдікте Эшби ортасында 42,4 % дан 77,2 % сәйкес болды.  Ал Алматы облысы топырақ үлгелерінде 10-20см тереңдікте 58,4%  дан 99,1 % дейін кездесті (1 кесте және 1 сурет).

 

1 Кесте. Azotobacter туысына жататын бактериялардың топырақ түйіршікті әдісімен өсуі

 

№	Топырақ үлгілері	Тереңдік, см	бактериялардың топырақ түйіршіктерінде  өсуі, %
			маннит	сахароза
1	2	3	4	5
1	Атырау, Еркинқала	0-10	10,4	28,2
		10-20	61,2	98,3
2	Ақмола облысы, Урысай қаласы	0-10	37,2	76
		10-20	42,4	77,2
		20-30	36,2	75,4
3	Алматы облысы, Агробиостанция	0-10	18,4	50,4
		10-20	58,4	99,1

 

Қазақстанның  әр түрлі аймақтарынан алынған топырақ  үлгілірен топырақ пластинкасы  әдісі қолдана отырып азот тұтушы бактериялардың санын анықтағандағы  мәліметтері 2 кестеде көрсетілген.  Сонымен Атырау облысының топырақ  үлгілерінде азоттұтушы бактериялардың мөлшері 10-20 см тереңдікте 28,2 ± 0,07 КТБ г/топырақ болса, Ақмола облысы топырақ үлгілерінде 10-20 см тереңдікте 36,2 ± 0,02 КТБ г/топырақ сәйкес болды.  Ал Алматы облысы топырақ үлгелерінде 10-20 см тереңдікте 19,1 ± 0,03 КТБ г/топырақ кездесті (2 кесте және 2 сурет).

 

 

 

 

1 Сурет– Құрамында әр түрлі көміртегі бар  Эшби қоректік ортасында Azotobacter туысына жататын бактериялардың топырақ түйіршікті әдісімен өсу көрінісі

 

 

2 Кесте. Azotobacter туысына жататын бактериялардың топырақ пластинкасы әдісімен өсу қабілеті

№	Топырақ үлгілері	Тереңдік, см	Өсіп шыққан азотобактериялардың  мөлшері, КТБ г/топырақ
1	2	3	4
1	Атырау, Еркинқала	0-10	17,2 ± 0,05
		10-20	28,2 ± 0,07
2	Ақмола облысы, Урысай қаласы	0-10	17,2 ± 0,06
		10-20	36,2 ± 0,02
		20-30	16,1 ± 0,03
3	Агробиостанция, ҚазҰУ	0-10	12,2 ± 0,050
		10-20	19,1 ± 0,03

 

 

   

 

2 Сурет - Azotobacter туысына жататын бактериялардың топырақ пластинкасы әдісі арқылы өскендегі көрінісі

 

Зерттеу жұмысымызды  жалғастыру барысында  Қазақстанның әр түрлі аймақтарынан алынған топырақтардан Атырау облысы, Ақмола облысы және Алматы облыстарының топырақтарынан Azotobacter туысына жататын бактерияларды бөліп алу жүргізілді. Ол үшін азот тұтушы бактериялардың санын анықтап бөліп алу үшін жалпыға ортақ әдіс – он еселік сұйылту әдісін қолдана отырып құрамында маннит және сахароза қосылған Эшби тығыз қоректік орталарына топырақ үлгілерінен егу жүргізілді. 

Зерттеу барысында алдымен әр түрлі топырақ  үлгілеріндегі азот тотықтырушы  микроорганизмдердің санын анықталды. Зерттеу нәтижесі 3 суретте көрсетілген.

Алынған зерттеу нәтижесі бойынша Қазақстанның әр түрлі аймақтарынан (Атырау, Еркін қала; Ақмола облысы, Урысай қаласы; Алматы облысы, Агробиостанция) топырақ үлгілерінің барлығында азот тотықтырушы бактериялардың саны ішінде Атырау облысы, Еркін қаладан алынған топырақтағы микроорганизмдердің саны маннит қосылған Эшби ортасында 48,3±0,8х10³, ал сахароза қосылған ортада 78,3±0,5х10³ КТБ г/топырақ құрады. Ақмола облысынан алынған топырақ үлгілерінде 77,1±1,2х10³ және 87,2±0,9х10³ сәйкес болды. Ал, Алматы облысы топырақ үлгілерінде маннит қосылған ортада 34,1±0,2х10³, сахароза қосылған Эшби ортасында 61,3±1,4 х10³ құрады.

Сонымен, жүргізілген зерттеу нәтижелерінде  зерттелген топырақ үлгілерінің  арасында Ақмола облысынан алынған  топырақ үлгілерінде басқа топырақ  үліглерімен салыстырғанда азот тұтушы бактериялардың саны жоғары болды  және 77,1±1,2х10³ және 87,2±0,9х10³ құрады (3сурет және 4сурет).

 

 

3 Сурет  - Топырақтан бөліп алған Azotobacter туысына жататын бактериялардың мөлшері

 

 

 

4 Сурет - Топырақтан бөліп алған Azotobacter туысына жататын бактериялардың колонияларының көрінісі

 

Сонымен Қазақстанның әр түрлі топырақтарынан 23 изолят бөліп алдық. Ары қарайғы  зерттеу жұмыстарымызда осы бөліп  алған бактерияларды қолдандық.

 

3.2 Azotobacter туысы бактерияларының биологиялық қасиеттерін зерттеу

 

Микроорганизмдердің негізгі  биологиялық қасиеттеріне әр түрлі ферментік белсенділіктері  жатады.

Ферменттер зат алмасуында маңызды рөл атқарады, олар клеткадағы биохимиялық процестерді бағыттап, әрі жылдатып отырады. Организмдердің өміршеңдігі ферменттер катализдейтін биохимиялық реакциялардың қиындықтарымен байланысты болады және кез-келген өзгеріс зат алмасуының бұзылуына әсер етеді. Агрономиялық практикада қолданылатын әр түрлі физиологиялық белсенді байланыстардың әсері – дәрілік заттар, өсу стимуляторлары, гербицидтер, әртүрлі химикаттардың да айналымдағы заттар алмасуына әсері мол. Сонымен,  ферменттер әсерінің заңдылықтары және оларға әсер ететін әртүрлі стимуляторлар, ингибиторлар ауыл шаруашылығында барлығы да маңызды орынды алады [72].