Азотобактер туысы бактерияларының фитопатогенді саңырауқұлақтарға қатысты антогонистік белсенділігі бар штамдарды сұрыптау

Ресейде қазіргі кезде P. Fluorescens негізінде “ризоплан” коммерциялық атауы бар жалғыз препарат тіркелген. P.aureofaciens BS1393штамы негізіндегі, коммерциялық атауы  “псевдобактерин” биопрепарат тіркеуден өтуге жақын. Ол дәнді дақылдар мен көкөніс дақылдарын  фитопатогендерден қорғау құралы ретінде, дала сынағынан табысты өтті.

Сонымен қазіргі кезде  дұрыс іріктеліп алынған  PGPR Pseudomonas штамдарын тиімді пайдалану мүмкін. Осы бағытта жүргізіліп жатқан белсенді зерттеу жұмыстарымен жасалынып жатқан жаңа технологиялар, осы биопрепараттардың тиімділігін едәуір арттырады.

Bacillus thuringiensis-тің фитопатогенді саңырауқұлақтарға қатынасындағы дельта–эндотоксиннің антифунгиональді әсерін зерттеу

Bacillus thuringiensis көптеген түрлері құрамы бойынша гомологиялық δ–эндотоксиндерді өндіреді. δ–эндотоксиндер параспоральды кристалдар түрінде ұйымдастырылған және бірқатар фитопатогенді өсімдіктерге инфекционды көптеген ауру тудыратын саңырауқұлақтарға Fusarium, Bipolaris, Phythopthora, Alternaria, Risoctonia–ға цитотоксикалық әсер етеді.

Бұл жұмыста δ–эндотоксин продуценті ретінде Bacillus thuringiensis subs sp. Thuringiensis 202 штамы қолданылды. Тест – обьект ретінде келесі фитопатогендерді саңырауқұлақтарды: Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici, Fusariumgraminearum–астық дақылдарының шіруін тудырушы Phytopthorainfestans штамдары 3 және 5–картоп және қызанақ фитофторозын туғызушылар қолданылады.Тестілеуден өткізілген фитопатогенді саңырауқұлақтар δ–эндотоксиндерге түрлі сезімталдықты корсетті.

Тыныс алу белсенділігін  зерттеу көрсеткендей Старр ортасына саңырауқұлақтарды ауыстырып егу  тыныс алу жылдамдығының ұлғаюымен  айқындалады, ортада көміртегі көздерінің құрамының ұлғаюымен байланысты.

Алғашқы екі минутында F.graminearum – ның тыныс алу жылдамдығы сол ортадағы өсу оптималдылығы төмендейді (0,018 мм/ мин). Концентрациясы 0,05% δ–эндотоксинді 0,1мл инкубирлеу ортасына қосқанда саңырауқұлақтық тыныс алу уақыты жақында ғана тест  – организмнің тыныс алу жылдамдығын бірден ұлғайтады.

Бұл тәсіл Bacillus thuringiensis  δ–эндотоксиндерінің фитопатогенді саңырауқұлақтарына сезімталдық деңгейін айқындау үшін қолдану мүмкін.

Көкөніс дақылдарының ризосфераларындағы фитопатогенді саңырауқұлақтарға  бактериялардыңмантагонисттік әсері.

Қазіргі уақытта фитопатогенді  микрофлорамен күрестің актуальді  тәсілі ретінде, өсімдік ризопланын белсенді түрде мекендеуге қабілетті  және өсімдікпен тамыр экзометаболиттері  құрамында жеткізілетін қоректік заттарды қолданатын ризобактериялар қолданылады. Фитопатогендерді биологиялық бақылау  биотехнологияның қарқынды дамушы саласы болып табылады. Дәлірек айтқанда соңғы 10 жыл көлемінде фитопатогендерді биологиялық басқару бойынша өнеркәсіптік жылыжайларда оң нәтижелі тәжірибелер алынды. PGPR(Plant Growth – Promoting Rhizobacteria)штамдары негізінде биобақылауды іске асыру үшін тииімді биопрепараттар алудың жаңа жолдары қарастырылуда.

PGPR штамдары өз мүмкіндіктерін толығымен көрсетуі үшін, тамырдағы экзометаболиттердің формалары, оларды оңай утилиздей алатындай күйде болу керек. Бұған түрлі көздерден бағытталған таңдау арқылы (топырақтар, жылыжай субстраттары) . Өсімдік тамырынан бөлінетін белгілі генотиптерге ұқсастығы жоғары штамдарға байланысты. Осылайша, PGPR штамдарының биоқабықшаның скринингін зерттеудің бірегей аймағы болып табылады және ризобактерия белсенділігінің антагонистік қасиетін зерттеуде зертханалық жағдаймен қоса, PGPR штамдарының ризосфераның шынайы жағдайларында да сыннан өткізілуі керек.

Биотехнология біздің ғаламшарымыздың  өнеркәсіптік, ауыл шаруашылық және тұрмыстық  қалдықтармен ластану деңгейін азайту мүмкіншілігіне ие болуы мүмкін. Қазіргі  өндірістік табыстар қалдық технология жасауға бағытталған, оңай ыдырайтын  полимерлер негізіндегі (биогенді шығу тегі бар:поли-р-оксибутират, полиамилозалар) және полимерлерді белсенді ыдырату қабілеті бар микроорганизм–ыдыратушыларды (полиэтилен, полипропилен, поли хлорвинилен). Биотехнологтар өз күштерін пестицидті ластаушылармен күресуге жұмсалуда.

1.4 Азотобактериялардың ауылшаруашылық практикасында қолданылуы

 

 

Бактериалды препараттардың өндірістік өндірілуі  және қолданылуына 100 жылдан асты. Азот сіңірушілердің ашылуы солай аталатын микробтық тыңайтқыштың пайда болуына  алып келді. 1895 жылы Наббе және Хлитрен  микробты патенттеді. Ол 17 нұсқада түрлі  өсімдіктер үшін шығарылды және азотсіңіруші микроорганизмдердің топырақпен, шымтезекпен, құммен және тезекпен орналасқан культурасы. Нитрагенді топыраққа өндіру немесе дәндерді өңдеу инокуляция деп аталды және шаруаға өнім сапасымен санын ұлғайтуға мүмкіндік берді. 20 ғасырдың І жартысында бұршақ тұқымдас және бұршақ тұқымдас емес дақылдар үшін микробты препарат-дақылдар үшін микробты препараттар жасау жұмыстары бойынша ғылыми-зерттеу жұмыстары көптеп жүргізілді. Азоттұтқыштарды қабілетті белсенді препараттарды қолдану әрдайым жоғары әсер бермеуі мүмкін, себебі, басты рольді өсімдік атқарады [37].

Доросинский М.М. көп жылғы отандық және шетел  мәліметтерін талдай келе, нитрагенді қолдану жаңадан егіліп жатқан бұршақ тұқымдастарға ғана емес, ескілеріне де тиімді екендігін дәлелдеді. Доросинскийдің пікірінше, нитрагенді қолдануды топырақ-климаттық  аудандарға сәйкес аудандастыру қажет. Қарағойшиева өз зерттеулерінде, жергілікті өсімдіктердің түйнегінен алынған  бактерия штамдарын қолданғанда, өнімділік 18 ц /га-н 21,2-25,8-26,1 ц/га көтерілді. Сонымен  қатар ол түйнектер ерте пісіп  жетілетін сорттарға қарағанда  кеш пісетіндер түйнек көп түзіледі [38].

XX ғасырдың соңында көптеген елдерде 70-80% бұршақ тұқымдас өсімдіктердің пайызы нитрагинизациялауға ұшырады. Дәстүрлі түрде бұршақ тұқымдастарды өсірумен айналысатын аудандарда нитрагин қолданудан өнім мөлшері 2-4%соя дәні; [39-40] 1-2 ц/га асбұршақ дәнін құрады.

Қазақстанда (1970-1980 ж) бұршақ тұқымдас өсімдіктердің  тамырындағы түйнек бактерияларымен  микробиология және вирусология  институттарының ғылымдары ҚР ҒБМ қарасты топырақтану институты, В.Р. Вильямс атындағы институты айналысқан [41-43].

Микробиология және вирусология институттарының  микроорганизмдер коллекциясында, соя, жоңышқаға арналған жоғары сапалы симбиотикалық  азотсіңіруші микроорганизмдер бар. Топырақтану  институтында Алибекова соя өнімділігінің 2-4 есе арттыратын Bradirhizobium japonicum куьтурасын бөліп алды. Нитрагин алудың технологиялық негізіне түйнек бактерияларының культураларын өсіру, кейін тұрақтандырғыштар қосып кептіру жатады.

Совет одағында азотобактеринді қолдану С.П.Костачевтың  ұсынуы бойынша 30ж басталды. 1г тыңайтқышта 40 мин жуық азотобактерин клеткалары болды. Азотобактериннің өсімдікке  ықпалы көп түрлі: азоттты қоректендіруді жақсартады өсімдіктің өсуін жеделдетеді. Фунгистикалық заттар өндіру арқылы тамыр аумағының дамуын тежейді [44].

Азотобактериннің  топыраққа дәрумен бөлуінің маңызы өте зор. Дәндерді азотобактермен өңдегенді  жүгері және бұршақ өскіндерінде тотығу ферменттерінің белсенділігі ұлғаяды.

Дәндерді  бактеризациялау үшін жергілікті топырақтардан  бөлініп алынған штамдары, басқа  жерден бөлініп алынған азотобактерлерге қарағанда ұтымдырақ. Топырақ –  климаттық жағдайлардан басқа азотобактерин тиімділігіне азотобактердің физиологиялық қасиеті; азоттұтыну физиологиялық белсенді заттардық физиологиялық белсенді заттардың синтезі, фитопотогенді микроорганизмдердің дамуын тежеу қабілеті маңызды [45,46].

Мәскеуде  Внил бакпрепарат зерттеушілері  көрсеткендей, олар құрғақ азотобактеринді 5 жыл көлемінде көкөніс және техникалық дақылдардың көшетін немесе  дәнін  егетін күні өңдеді немесе оны қоректік затқа қосып отырды. Дәндерді өңдеу 3 жыл ішінде асханалық қызылшаның өнімін 13,6% азықтық қызылшаның өнімін 24,9% жоғарылатты, ерте пісетін қырыққабатты 20,8, кеш пісетінді 26,8% ұлғайтты [47,48].

50 жылдары  азотсіңіруші микроорганизмдер  ретінде негізінен азоттобактер  культурасы қолданылды. Қазір олардың  қатары кеңейтілген (Az.chroococcum, Az.vinelandii, Az. paspali) сонымен қатар Cl.pasterurianum, Beijerinckia, Kl.pneumoniae, филлосфералы бактериялар, көп жасыл балдырлар.

Қазіргі кезде бұршақ, астық және культураларға  қолданылатын микропрепараттар спектірі өте кең. Негізінен биопрепарттар  жасауға 2 жағдай себеп болды: 1) минералды тыңайтқыштарды өндірудегі шығындардың көптігі, 2) минералды тыңайтқыштарды ауылшаруашылығында көп көлемде қолданудан туындаған экологиялық мәселелер. Алайда биопрепараттарды қолдану барлық кезде тұрақты нәтиже бермейді, сонымен қатар топырақ қасиетіне тәуелділігі жоғары [49].

Соңғы жылдары  біруақытта бәрнеше бактериалды  тыңайтқыштарды немесе комплексті тыңайтқыштарды қолдану іске асырылуда, онда белсенді штамдардың консорциумы қолданылады, ол өзіне түрлі азот сіңіруші түрлерінің пайдалы қаситеттерін алады. Практика көрсеткендей комплексті биотыңайтқыштарды  қолдану ауылшаруашылық өнімдерінің  түсімін 20-25% жоғарлатады және өсімдік топырақтарының шіруі айтарлықтай азаяды.

Бұршақ  тұқымдас емес дақылдардың өнімділігін  арттыру үшін өсімдік дәндерін бактериалды  препараттармен инокуляциялағанда  бұршақтұқымдас емес дақылдардың өнімділігі артты.

Емцовтың  пікірінше, биопрепарттарды қолдану  өсімдіктердің өнімділігін арттырады  ерте өнім алуға мүмкіндік береді, оны сақтауды жақсартады [50].

Кожемияконың  көптеген зерттеулерімен анықталғандай, әрбір өсімдік түрі үшін, өз шатмдарын  таңдау керек [51]. Дұрыс таңдалған ассоциативті бактерия штамдары өсімдіктің минералды қоректенуін, өнімді және оның сапасын арттырады. Ол өңделген өсімдіктердің тамыр жүйесінің сіңіруі жақсарумен түсіндіріледі. [52, 53]

Үшеулік симбиотикалық жүйе ұтымдылығы жоғары. Тарахин қызметкерлерімен бірге  жүргізген зерттеулерінде препаратты комплекс күйінде қолданған, жеке дара қолданғанның тиімділігін дәлелдеді.

Завалин қызметкерлерімен бірге құрамында  микробты биомасса және түйіршікті тыңайтқыштары  бар биотыңайтқышты алу тәсілін  жасап шығарды. Түйіршікті тыңайтқыш ретінде кәдімгі минералды тыңайтқыш биомасса ретінде – бактериалды препарат Bacillus subtillis. Мұнда дән массасы және өсімдіктермен сіңірілуі 1,5-1,22 есе ұлғайды [54-60].

Жиньшинь  тамырынан ММУ коллекциясына  №452 енгізілген микролицит Acremonium sp ашытқысынан, Rhodotorula glutinis, Enterobacter agglomerans, Azotobacter beijerinckii, бактерияларынан тұратын өсімдіктердің өсуін реттейтін құрамында гиббереллин пуринді негіз, аминқышқылдары бар препаратты алды. Препарат ауылшаруашылық культураларының өнімділігін және өсімдіктің зақымдану деңгейін төмендетеді. [61, 62].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 ЗЕРТТЕУ НЫСАНЫ, МАТЕРИАЛДАРЫ ЖӘНЕ ӘДІСТЕРІ

 

          2.1 Зерттеу материалдары

 

 

Қазақстанның  әр түрлі облыстарынан алып келінген, түрлі тереңдіктегі топырақ үлгілерін  пайдаландық.

1. Атырау, Еркинқала тереңдік 0-10, 10-20 см

2. Ақмола облысы, Урысай қаласы тереңдік 0-10,10-20, 20-30 см

3. Агробиостанция, ҚазҰУ тереңдік 0-10, 10-20 см

 

2.2 Қоректік орталар

 

 

     Азотобактерияларды бөліп алу және есептеу үшін Федров ортасы қолданады (г\л):

1.глюкоза(маннит)-20,

2.К₂НРО₄-0,3

3.CаНРО₄-0,2

4.К₂SO₄-0,2

5.MgSO₄-0,3

6.NaCl-0,5

7.FeCl₃-0,01

8.CaCO₃-5,0 смесь микроэлемент-1мл, агар-20гр, дистилденген су

     Федоров бойынша микроэлемент қоспасы

H₃BO₃-5,0,(NH₄)₂MoO₄-5,0,KL-0,5,NaBr-0,5,ZnSO₄-0,2,Al(SO₄)₃-0,3,дистилденген су.

     Оллигонитрафилді микроорганизмдер үшін арналған Эшби ортасы (г\л):

1.K₂HPO₄-0,2

2.MgSO₄-0,2

3.NaCl-0,2

4.K₂SO₄-0,1

5.CaCO₃-5,0

6.сахароза-20гр

7.агар-       20гр.

Орталарды 1 атм 30минут залалсыздандырады [63].

 

2.3 Қолданылған  әдістер

 

 

2.3.1 Әр түрлі топырақ үлгілеріндегі азотобактериялардың санын анықтау және бөліп алу үшін  3 әдісті пайдаландық.

1. Топырақтан азотобактерияларды бөліп алу үшін топырақ түйіршіктері әдісін қолданады.

Алдымен стерильді петри табақшасына  10г топырақ үлгілерін өлшеп алады. Содан табақшаға топырақ паста тәрізді күйге келгенше стерильді құбыр суымен ылғалдайды. Оны Эшби ортасына әр петри табақшасына трафарет тәрізді етіп 25 топырақ түйіршігін қойып шығады. Табақшаларды термостатқа ылғал камераға қояды. 4-6 тәуліктен соң тәжірибенің нәтижесін топырақ түйіршіктерінің санын және өсіп шыққан шырышты азотобактерия колонияларын есептейді. Азотобактер колонияларын осы ортада жиі өсетін липомицетті ашытқылардан ажырата білу керек.

Азотобактер колониялары негізінен шырышты, тест тәрізді консистенциялы, ақ жылтыр емес, уақыт өте қоңырқай пигмент  түзетіні байқалады. Микроскоппен қарағанда  клеткалары семіз қысқа таяқшалы немесе коккалар, жиі тізбектеліп  жұптарымен тұрады, капсуламен қоршалған.

Ашытқы  липомицеттер шырышты, әйнек тәрізді  жарқыраушы колония түзеді.14-16 тәулікте пайда болады.

2. Топырақ пластинкасы әдісімен топырақ үлгілерінен 40-50г топырақ алып, оны мына заттармен байыттық:маннит-0,5, K₂HPO₄-0,1, бор-0,4. Фосфорлы стерильді табақшалардың астына ұсақталған стерильді шыны бөлшектерін салып қоямызда, әр топырақ үлгісін стерильді құбыр суымен паста тәрізді етіп жаймалаймыз. Содан соң табақшадағы топыраққа аэрация жүру үшін түтікшелер салдық, әр табақшаға 4-5 түтікшеден. Ол да стерильді және спиртке салынған болу керек. Табақшаларды термостатқа қоямыз. 4-5 күннен соң ылғалды топырақтың жоғарғы бетінде азотобактериялардың кіші колонияларын байқаймыз.

3. Он еселік сұйылту әдісі арқылы 10x2 және 10x3 дәрежелеріндегі сұйылтудан алып Эшби ортасына 3 қайтарымнан ектік.