Возбудители свиного гриппа

На подсушенные и зафиксированные (например, холодным ацетоном) препараты  исследуемых клеток наносят специфические  гипериммунные люминесцентные сыворотки  к вирусам гриппа А(Н1N1), A(H3N2) и  В. После 30-минутной инкубации предметные стекла тщательно промывают буфером, подсушивают и осуществляют микроскопическое изучение клеток с помощью люминесцентного  микроскопа.

Локализация и характер свечения антигена вируса зависят от стадии развития возбудителя в клетке, а  также от срока возникновения  гриппозной инфекции. В первые 3 дня  заболевания антиген чаще локализуется в ядрах клеток цилиндрического  эпителия при одновременном диффузном  или гранулярном свечении цитоплазмы в той же или в разных клетках. Часто определяется равномерное  гомогенное свечение всей клетки с  плохой дифференциацией ее внутренней структуры.

При затухании инфекционного  процесса свечение преимущественно  наблюдается в цитоплазме или  в отдельной ее части в виде гранул.

При сопоставлении количества пораженных клеток, находящихся в  поле зрения люминесцентного микроскопа, и срока течения гриппа отмечено их повышение (6-10) в первые 3 дня заболевания.

Диагностически значимым является специфическое свечение пяти и более клеток цилиндрического  эпителия с яркостью не менее чем 2+.

7) Выделение вируса гриппа на куриных эмбрионах

Этот метод диагностики  гриппа является наиболее доступным  и чувствительным. Используют 9-11-дневные  куриные эмбрионы, которые заражают инфекционным материалом в объеме 0,1 мл в амниотическую и аллантоисную полости, после чего эмбрионы инкубируют при температуре 33-34°С 72 ч.

При выделении вируса гриппа С материал инокулируют только в  амниотическую полость 7 дневных  куриных эмбрионов и инкубируют при температуре 33°С 5 сут.

После соответствующей инкубации  эмбрионы охлаждают на протяжении 16-18 ч при 4°С и осуществляют их вскрытие. Далее отбирают эмбриональные жидкости - амниотическую и аллантоисную, в которых проводят индикацию  вируса гриппа. Для этого используют реакцию гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами морской свинки, петуха или человека с группой крови 0. Доказано, что  эритроциты млекопитающих более  чувствительны, чем куриные, для  индикации вируса в эмбриональных  жидкостях на ранних пассажах. Когда  вирус уже адаптирован к куриным  эмбрионам для индикации целесообразно  использовать эритроциты петуха, которые  больше по размерам и быстрее оседают.

Если результат РГА  отрицательный, проводят два-три дополнительных слепых пассажа, после чего (при сохранении результата РГА) исследование материала  прекращают, а образец считают  несодержащим вирус гриппа.

В случае наличия агглютинации эритроцитов собранную эмбриональную  жидкость освещают центрифугированием в течение 10 мин при скорости 10 тыс. об./мин и хранят при 4°С. При  необходимости дополнительного  культивирования выделенного вируса эмбриональную жидкость разводят раствором  Хенкса или забуференным физиологическим  раствором до концентрации 10-100/ГАЕ  мл и используют для последующего заражения куриных эмбрионов.

При положительной РГА  проводят титрование изолята в этой же реакции. Для этого изолят последовательно  разводят с кратностью 2 в двух параллельных рядах лунок планшета для иммунологических исследований от 1:2 до 1:1280 в объеме 0,2 мл. При каждом разведении в каждую лунку добавляют по 0,2 мл физиологического раствора натрия хлорида и по 0,4 мл 1% взвеси эритроцитов петуха. Через 20-30 мин учитывают результат титрования вируса в РГА. Различие титра в двух рядах может не превышать одно-двукратного разведения. Если разница больше, титрование следует повторить. Вычисляя титр (в случае двукратного различия), высчитывают его среднеарифметическое значение.

Если титр в РГА 1:8 или  больше, вирус идентифицируют в реакции  торможения гемагглютинации (РТГА). Если он меньше чем 1:8, его стараются повысить.

Существует несколько  методов повышения гемагглютинирующей активности свежевыделенных штаммов  вируса гриппа. Чаще всего это - проведение дополнительных пассажей на куриных  эмбрионах методом пограничных  разведений. Успешно используют и  ультразвук, разрушающий ингибиторы, блокирующие гемагглютинины вируса. После 5-7-минутной обработки ультразвуком гемагглютинирующая активность вируса возрастает в 4-16 раз, что ускоряет возможность  идентификации выделенных вирусов  в РТГА.

После определения достаточного гемагглютинирующего титра изолированного вируса гриппа, его идентифицируют в РТГА. Для этого готовят рабочее  разведение вируса, который содержит 4 ГАЕ в заданном объеме жидкости (если титровали в объеме 0,2 мл, то в 0,2 мл). Контролируют правильность приготовления  рабочего разведения и, если необходимо, корригируют его. После такой  коррекции необходимо снова проверить  правильность рабочей дозы возбудителя. Далее осуществляют постановку РТГА: к последовательным разведениям  коммерческих диагностических сывороток  против возбудителей гриппа А (Н1N1), A (H2N2), A (H3N2), В и С до определенного  в инструкции титра добавляют  равный объем рабочего разведения выделенного  вируса в каждую лунку каждой сыворотки. После определенной экспозиции (чаще 1 ч при комнатной температуре) в каждую лунку вносят двойной  объем эритроцитов петуха и через 30 мин определяют результат.

В случае использования для  идентификации вируса гриппа в РТГА диагностических иммунных сывороток, относительно которых не указано, что  они получены к ингибиторрезистентным  штаммам вируса гриппа, их освобождают  от неспецифичных ингибиторов гемагглютинации  вируса или для контроля берут  неиммунную сыворотку крови от животного  одного и того же вида, при иммунизации  которого получена диагностическая  сыворотка. Если такая контрольная сыворотка тормозит гемагглютинацию вируса в титре 1:20-1:40, то идентификацию вируса следует проводить только после устранения ингибиторов.

В тех случаях, когда для  идентификации вирусов гриппа используются диагностические сыворотки, полученные к ингибиторрезистентным штаммам, дополнительная обработка их не нужна.

Таксономическая характеристика выделенного вируса гриппа определяется в РТГА по той диагностической  сыворотке, которая тормозит его  гемагглютинацию. После идентификации  вируса вирусологическое исследование считается законченным.

Если выделенный вирус  значительно отличается в титрах РТГА от эталонного штамма (к которому получена диагностическая сыворотка, и титр которого указан на этикетке) или идентификация его в РТГА оказывается неудачной, тип вируса можно определить в реакции связывания комплемента (РСК).

В РСК используют гемолитическую сыворотку в трехкратном титре, две дозы предварительно оттитрованного комплемента и аллантоисный антиген  в количестве 12-16 ГАЕ (по РГА). Разводить  антиген ФБР (рН 7,0-7,2) выше, чем 1:10 не рекомендуется.

Использование в РСК иммунных сывороток морской свинки и аллантоисного  антигена не нуждается в титровании комплемента в их присутствии, поскольку  они не обладают антикомплементарными свойствами.

 

Заключение.

Прогноз течения свиного гриппа условно благоприятный, при адекватном иммунном статусе и у лиц не входящих в группы риска время заболевания не превышает 2 недель и заканчивается полным выздоровлением. Трудоспособность полностью восстанавливается.При сниженном иммунитете, а также у лиц, входящих в группы риска, возможно развитие тяжелых, опасных для жизни осложнений.

Следует отметить, что смертность при инфицировании данным вирусом  не превышает смертность при поражении другими штаммами вируса. Согласно данным Гарвардской школы общественного здоровья (на основе статистики, собранной в США, и модельных расчётов), смертность от свиного гриппа составляет 0,007 % от числа заболевших. Этот показатель ниже, чем у некоторых форм обычного сезонного гриппа.

Для профилактики свиного  гриппа специалистами Всемирной  организации здравоохранения были подготовлены следующие рекомендации:

1) Регулярно и часто  мыть руки с мылом.

2) Избегать тесных контактов  с лицами, имеющими признаки простудных  заболеваний.

3) Вести здоровый образ  жизни, соблюдать режим сна  и отдыха.

4) Рацион питания должен  содержать достаточное количество  белков и витаминов.

Для иммунизации применяют  инактивированную или живую ослабленную  вакцину, полученную из определенных типов  вируса гриппа, культивируемого на куриных эмбрионах. Вакцину закапывают в носовые ходы или распыляют  пульверизатором в верхние дыхательные  пути. Имеются сухие противогриппозные  моновакцины (из одного типа вируса) и  поливакцины (из 2—3 типов).

Эффективность вакцинации зависит  от того, насколько создателям удается  предсказать циркулирующие в  данном эпидемиологическом сезоне штаммы. Помимо вакцинации для экстренной профилактики гриппа и острой респираторной вирусной инфекции применяется интраназальное введение интерферона.

Для лечения используют антибиотики: экмолин с пенициллином, интерферон, рибонуклеазу, гамма-глобулин, а также  синтетические препараты — римантадин и амантадин.

 

 

 

 

 

 

 

  Список используемой литературы:

1. Борисов Л.Б. "Медицинская  микробиология, вирусология, иммунология" -М.: МИА, 2005.

2. Деева Э.Г. "Грипп. На пороге пандемии". - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007

3. Болоцкий И.А., Васильев А.К., Семенцов В.И. "Инфекционные болезни свиней" Феникс, 2007

4. Кишкун А.А. "Иммунологические  и серологические исследования  в клинической практике" М.: МИА, 2006