Возбудители свиного гриппа

 Например, вирус гриппа  А с гемагглютинином NSW1 вызвал  в 1918 г. пандемию «испанки»,  унесшей 20 млн. человеческих жизней. В 1957 г. «азиатский» вирус гриппа (H2N2) вызвал пандемию, охватившую  более 2 млрд. человек. В 1968 г.  появился новый пандемический  вариант - вирус гриппа A (H3N2), получивший  название «гонконгский», который  продолжает циркулировать до  настоящего времени. В 1977 г.  к нему присоединился вирус  типа A (H1N1). Это оказалось неожиданным,  поскольку идентичный вирус уже  циркулировал в 1947-1957 гг., а затем  был полностью вытеснен «азиатским»  подтипом.

 В этой связи возникла  гипотеза о том, что шифтовые  варианты вируса не являются  исторически новыми. Они представляют  собой циркулирующие в прошедшие  годы сероподтипы. Прекращение  циркуляции вируса гриппа, вызвавшего  очередную эпидемию, объясняется  коллективным иммунитетом населения,  сформировавшимся к данному антигенному  варианту возбудителя. На этом  фоне происходит селекция новых  антигенных вариантов, коллективный  иммунитет к которым еще не  сформировался.

 Пока неясно, где сохраняются  в течение длительного времени  шифтовые антигенные варианты (сероподтипы)  вируса гриппа типа А, вышедшие  из активной циркуляции в тот  или иной исторический период. Возможно, что резервуаром сохранения  таких вирусов являются дикие  и домашние животные, особенно  птицы, которые инфицируются человеческими  вариантами гриппозных вирусов  типа А и поддерживают их  циркуляцию в течение длительного  времени. При этом в организме  птиц происходят генетические  рекомбинации между птичьими  и человеческими вирусами, которые  приводят к формированию новых  антигенных вариантов. По другой  гипотезе вирусы гриппа всех  известных подтипов постоянно  циркулируют среди населения,  но становятся эпидемически актуальными  лишь при снижении коллективного  иммунитета.

7. Лабораторная диагностика.

1) Вирусологический метод диагностики.

Материалом для исследования смывы из носоглотки, выделения из носа, которые принимают сухими или  влажными стерильными ватными тампонами  в первые дни заболевания, мокроты. Вирусы можно обнаружить в крови, спинномозговой жидкости. При летальных  случаях забирают кусочки пораженных тканей верхних и нижних дыхательных  путей, головного мозга и т.п.. Носоглоточные смывы берут натощак. Больной должен трижды прополоскать горло стерильным физиологическим  раствором хлорида натрия (10-15 мл), который собирают в стерильную банку  с широким горлом. После этого  кусочком стерильной ваты протирают  заднюю стенку глотки, носовые ходы, затем ее окунают в банку со смывом. Можно взять материал стерильным, увлажненным в растворе хлорида  натрия тампоном, которым тщательно  протирают заднюю стенку глотки. После  забора материала тампон погружают  в пробирку с физиологическим  раствором, к которому добавлено 5% инактивированной сыворотки животных. В лаборатории  тампоны полощут в жидкости, отжимают у стенки пробирки и удаляют. Слив выдерживают в холодильнике для  отстаивания, затем отбирают среднюю  часть жидкости в стерильные пробирки.

К материалу добавляют  антибиотики пенициллин (200-1000 ЕД / мл), стрептомицин (200-500 мкг / мл), нистатин (100-1000 ЕД / мл) для уничтожения сопутствующей  микрофлоры, выдерживают 30 мин при  комнатной температуре и используют для выделения вирусов, предварительно проверив его на стерильность. Чувствительным методом выделения вирусов заражения 10-11-дневных куриных эмбрионов. Материал в объеме 0,1-0,2 мл вводят в амниотическую  или аллантоиса полости. Заражают, как  правило, 3-5 эмбрионов. Эмбрионы инкубируют при оптимальной температуре 33-34 ° С в течение 72 часов. С целью  увеличения количества вирионов в исследуемом  материале его предварительно концентрируют. Для этого используют методы адсорбции  вирусов на куриных эритроцитах, обработку 0,2% раствором трипсина с  целью усиления инфекционных свойств  вирусов или осаждают их по специальным  методикам.

После инкубации куриные  эмбрионы охлаждают при температуре 4 ° С в течение 2-4 ч, затем отсасывают стерильными пипетками или шприцем  алантоисну или амниотическую жидкость. В этой с помощью РГА определяют наличие инфекционного вируса. Для  этого смешивают равные объемы (0,2 мл) вирусмисткого материала и 1% взвеси эритроцитов кур. О положительной реакции (наличие вируса в материале) свидетельствует оседания эритроцитов в виде зонтика. При наличии в материале вируса, который имеет гемаглютинуючи свойства, его титруют с помощью развернутой РГА, определяя титр гемаглютинуючои активности. С помощью этой реакции определяют титр гемаглютинуючого вируса - наибольшее разведение материала, которое еще дает реакцию гемагглютинации. Это количество вируса принимают за одну гемаглютинуючу единицу (ГАО).

2) РТГА.

Для этого сначала готовят  рабочее разведение вирусного материала, которое содержит 4 ГАО вируса в  определенном объеме. Учет реакции  проводят после образования осадка эритроцитов в контрольных лунках. О положительной реакции свидетельствует  задержка гемагглютинации в исследуемых  лунках. Выделять вирусы гриппа можно, используя различные линии культур  клеток - эмбриона человека, почек обезьян, перевиваемой линии клеток почек  собаки (MDCK) и другие.

В клеточных культурах  проявляется цитопатическое действие вирусов (появление клеток с фестончатыми краями, вакуолями, формирование внутриядерных  и цитоплазматических включений), которая  завершается дегенерацией монослоя клеток. Для идентификации выделенных вирусов используют РТГА (при условии, если тите гемагглютинина составляет в культу рал ьний жидкости не менее 1:8). Кроме этой реакции можно использовать РГГадс, однако она менее чувствительна  и требует титра иммунной сыворотки  не менее 1:160 а также РСК, РН, РЕМА подобное.

3)  Иммуноферментный анализ.

(ИФА) получил широкое  распространение в диагностике  различных инфекционных заболеваний  в связи с высокой чувствительностью  и специфичностью анализа, высокой  проивзодительностью, простотой  проведения анализа и регистрации  результатов, возможностью использования  микроколичества диагностического  материала и автоматизации процесса. ИФА используют для определения  как антител, так и антигенов  в биологических жидкостях.

Иммуноферментный анализ позволяет обнаружить рибонуклеопротеиновый родоспецифический антиген вируса гриппа в носоглоточных секретах больных острой респираторной инфекцией. Разработаны отдельные тест-системы ИФА для диагностики гриппа А и В, то есть клинический материал исследуется с помощью двух тест-систем одновременно. ИФА в данном случае может применяться для этиологической диагностики случая респираторной инфекции или для скрининга клинических материалов перед вирусовыделением. Однако этот метод не позволяет выявить штаммовую специфичность возбудителя гриппа.

Материалом для исследования служат выделения из носовой полости  больных респираторной вирусной инфекцией, получаемые путем аспирации  секретов с помощью аспирационных  емкостей, соединенных с вакуумным  насосом. Отобранные секреты разводят в 5 раз фосфатно-солевым буферным (ФСБ) раствором с 0,05% твина-20. Для  ИФА-диагностики гриппа допускается  использование и носоглоточных  мазков. При этом ватные тампоны  со слизью и клетками ресуспендируют в 2 мл ФСБ с 0,05% твина-20, а перед  исследованием двукратно замораживают-размораживают  для выделения вирусных антигенов  из клеток. Подготовленные клинические  материалы можно сохранять на протяжении 3-4 мес. при температуре - 15-20°С.

ИФА базируется на выявлении  антигенов вирусов гриппа А и  В с помощью моноклинальных (МК) антител к рибонуклеопротеину (РНП) соответствующих возбудителей в  сендвич-варианте: противогриппозные  МК антитела адсорбируют в лунках планшета, после чего к ним последовательно  добавляют контрольный и исследовательский  материалы, а после соответствующей  экспозиции - конъюгант специфических  МК антител с пероксидазой хрена. Образованный иммунный комплекс: МК - антитела к РНП вирусов гриппа А/В - РПН-антигены вирусов гриппа А/В - меченные пероксидазой МК-антитела к РНП вирусов гриппа А/В выявляют добавлением субстратной  смеси, в состав которой входят перекись водорода (субстрат пероксидазы) и ортофенилендиамин (краситель). После определенной экспозиции (до появления желтой окраски в  лунках с положительными контрольными образцами) ферментную реакцию останавливают  серной кислотой. При проведении каждого  этапа ИФА лунки планшета перед  добавлением следующего компонента промывают буферным раствором.

Результаты рассчитывают с помощью автоматизированных спектрофотометров (ридеров) при длине волны 490 нм, определяя  показатели оптической плотности смеси  в лунках планшета. При этом учитывают  коэффициенты, указанные в инструкции к тест-системе, позволяющие рассчитать оптическую плотность, выше которой исследовательские образцы считаются положительными.

4)  ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод геномолекулярного исследования клинических и секционных материалов, который может применяться для  экспресс-диагностики гриппа. Однако чаще ПЦР-метод используется для  широкого спектра экологических  исследований на грипп. В основе метода - выявление в исследовательских  образцах генетических последовательностей  определенных вирусов гриппа и их амплификация к сотням миллионов  копий, идентифицируемых методом электрофореза  в полиакриламидном геле (ПААГ) или  гибридизационно-иммуноферментным анализом. В нашей стране ПЦР пока что  не нашла широкого применения в практической инфектологии.

Иммунохроматографический  анализ (ИХА), или быстрые тесты. Материалом для исследования являются носоглоточные  смывы, которые наносят на нитроцеллюлозный фильтр с определенными иммунными  ингредиентами, заправленный в пластиковую  кассету. Результат исследования учитывают  через 5-15 мин. При наличии антигенов  вируса гриппа проявляются две красные  полосы, одна из которых контрольная.

5) Серологическая диагностика.

Серологическая диагностика  гриппа базируется на выявлении возрастания  титра противогриппозных антител  в динамике заболевания или на определении специфических иммуноглобулинов класса М.

Для данного вида диагностики  гриппа чаще применяют РТГА. Последнюю  выполняют микрометодом с использованием микропланшетов для иммунологических исследований (общий объем реакции -100 мкл).

В процессе серологического  исследования сывороток крови в  РТГА используют их последовательные (начиная с 1:10) двукратные разведения на изотоническом растворе натрия хлорида, диагностикумы вирусов гриппа А(Н1N1), A(H3N2) и В в рабочем разведении 4 ГАЕ в 25 мкл, а также взвесь эритроцитов  петуха или человека с группой  крови 0 в концентрации 0,4-0,5% (соотношение  объемов перечисленных компонентов  РТГА 1:1:2).

Перед исследованием сыворотки  крови обрабатывают с целью освобождения их от неспецифических ингибиторов  гемагглютинации вирусов гриппа. Для этого чаще используют универсальный препарат - рецепторразрушающий энзим (РРЭ), подходящий для устранения неспецифической ингибиции гемагглютинации вирусов гриппа всех типов. РРЗ представляет собой фермент нейраминидазу, получаемую из нехолерных вибрионов.

Термолабильные мукополисахаридные ингибиторы разрушают прогреванием сывороток при температуре 56°С на протяжении 30 мин. Для освобождения от термостабильных ингибиторов  можно использовать риванол (этакридина лактат), двуокись углерода и т. п. Однако эти методы по эффетивности значительно  уступают методу обработки РРЭ, поскольку  могут частично разрушать и антитела.

Для серодиагностики гриппа можно исследовать и одну только сыворотку крови больного на наличие  противогриппозных иммуноглобулинов класса М, которые свидетельствуют  об острой инфекции. При отдельном  определении антител класса М  сыворотку крови больного предварительно разделяют на 2 порции, одну из которых  сохраняют до постановки определенной серологической реакции, а другую обрабатывают для разрушения макроглобулинов  класса М физическими или химическими  методами. Один из них - прогревание  порции сыворотки при 60 °С на протяжении 30 мин, второй - обработка порции сыворотки 2-меркаптоэтанолом. После этого  обе порции исследуют, например, в  РТГА. Снижение титров противогриппозного антигемагглютинина в 4 и более раз  в порции сыворотки, в которой  предварительно разрушали иммуноглобулин, свидетельствует об их наличии в  исследуемой сыворотке, что лабораторно  подтверждает диагноз гриппа.

Существует методика выборочного  удаления из одной порции исследуемой  сыворотки противогриппозных lg с  помощью белка А золотистого  стафилококка (штамма Cowan). При последующем  серологическом исследовании обеих  порций сыворотки выявление сниженного или неизмененного титра специфических  антител в обработанной порции свидетельствует  о наличии в ней иммуноглобулина, Отсутствие антител в обработанной порции сыворотки (при их наличии  в необработанной) позволяет сделать  вывод, что выявленные антитела принадлежат  к классу иммуноглобулинов, а респираторное  заболевание вызвано не вирусом  гриппа.

6) МФА

Метод флюоресцирующих антител (МФА, прямой метод Кунса) является довольно надежным методом быстрой диагностики  гриппа, позволяющим обнаружить антигены вируса гриппа непосредственно в  клиническом материале через 2-3 ч  от момента его взятия. МФА исследуют  клетки цилиндрического эпителия слизистой  оболочки в участке нижней носовой  раковины и задней стенки глотки, которые  отбирают сухими ватными тампонами  и помещают в среду для транспортировки  вирусов. В лаборатории тампоны  встряхивают, отжимают и удаляют, а  взвесь центрифугируют на протяжении 20 мин со скоростью 3 тыс. об./мин. Из осадка клеток готовят мазки на обезжиренном предметном стекле.

Для выявления антигенов  вируса гриппа в пробах секционного  материала делают отпечатки кусочков ткани легкого, а также готовят  препараты со слизистой оболочки трахеи и бронхов, соскребая клетки эпителия или плотно прижимая участок  пораженной слизистой оболочки к  стеклу. Из каждого образца исследуемого на грипп материала делают по 3 мазка  на стекле.