Тонкослойная хроматография. Применение в фармации

         В настоящей  работе приведены результаты  количественного ТСХ-определения некоторых тритерпеновых сапонинов, производных олеаноловой кислоты, в фармпрепаратах и извлечениях из растительного сырья.

         В качестве  объектов исследования нами были  выбраны тритерпеновые сапонины аралии маньчжурской (аралозиды). качественное определение которых в различных объектах освещено в работах, а также тритерпеновые сапонины сахарной свеклы — вещества с предварительно установленной фармакологической активностью. И те, и другие являются производными олеаноловой кислоты с небольшим (не более четырех) количеством сахарных остатков, что предполагает их сходное поведение в тонком слое сорбента

          В качестве стандартов использовали сумму аралозидов, выделенных из таблеток "Сапарал" и сумму сапонинов сахарной свеклы, выделенных из свежеубранных корневищ. Для нанесения на пластину готовили водно-спиртовые (80 % по этанолу) растворы сапонинов с содержанием последних 0,4 — 2,0 мг/мл. Хроматографирование проводили с использованием пластин для ТСХ "Силуфол" (Чехия) 15 х 15 см, "Армсорб" для ВЭТСХ (Армения) 6 х 10 см и "Сорбфил" (Россия) 10 х 10см. Высота подъема фронта, достаточная для полного разделения, составляла 10,6 и 6 см, соответственно. Пробы наносили при помощи мнкрошприца МШ-10 (Россия) на пластину, подогретую до 40 "С. Оптимальный объем наносимой пробы — 3-5 мкл. Нанесение проводили в несколько приемов так, чтобы диаметр стартового пятна не превышал 2 мм.

           Хроматографирование осуществляли при температуре 20 - 25 °С. По окончании элюирования пластины подсушивали на воздухе и обрабатывали детектирующим реагентом при помощи лабораторного стеклянного пульверизатора. Сканирование зон проводили с использованием сканирующего денситометра ^“Shimadzu CS-9000" (Япония). Сравнивали качество зон, получаемое при хроматографировании в трех, наиболее часто рекомендуемых элюирующих системах: I. хлороформ - метанол - вода (30:17:3): II. н-бутанол - этанол - аммиак (7:2:5); III. н-бутанол - вода - уксусная кислота (4:5:1), верхний слой; IV. бензол - этилацетат (1:1) (для сапонинов сахарной свеклы).

            В качестве детектирующих реактивов использовали 25 % спиртовый раствор фосфорновольфрамовой кислоты (малиновые пятна сапонинов на белом фоне). наиболее часто применяемый для количественных ТСХ-определений подобных соединений и 10 % спиртовый раствор фосфорномолибденовой кислоты, рекомендуемый для проявления зон тритерпеноидов [13] (зоны сапонинов темно-синие на желтом фоне). Обработка пластин парами аммиака в последнем случае позволяет обесцветить фон и повысить контрастность пятен.

            В результате проведенных исследований были выбраны оптимальные для денситометрического определения условия проведения хроматографического процесса. Лучшими из трех типов пластин были признаны "Армсорб" для ВЭТСХ. Высокой эффективности процесса способствует тонкий (II0 мкм) и однородный по фракционному составу (5—10 мкм) слой силикагеля, обеспечивающий хорошее разделение и минимальное размывание зон уже при подъеме фронта растворителя на 6 см. Почти не уступают им по разделительной способности пластины "Сорбфил", но время элюирования на них почти вдвое больше. Пластины "Силуфол" при достаточно высокой скорости элюирования позволяют разделить компоненты при большем хроматографичесюм пути, что приводит к некоторому размыванию зон, однако их использование также возможно.

Элюирование может быть проведено  достаточно качественно в любой из первых трех элюирующих систем. I дает выигрыш во времени, IV позволяет получить лучшее разделение сапонинов сахарной свеклы, чем первые три.

Оба детектирующих реагента дают достаточно стабильное окрашивание зон при проведении сканирования в течение 1 - 2 ч с момента проявления. По истечении этого срока зоны сапонинов на пластинах, обработанных фосфорнонольфрамовой кислотой, изменяют окраску от малиновой до фиолетовой, что может привести к искажению результатов количественного анализа при сканировании. Обработка фосфорномолибденовой кислотой в этом случае более предпочтительна. При хранении в защищенном от света месте пластины с зонами, проявленными этим реактивом, дали вполне воспроизводимые результаты по истечении нескольких месяцев с момента проявления.

          Предел обнаружения сапонинов составил 5 мкг в пробе при проявлении фосфорновольфрамовой кислотой и 0,5 мкг в пробе при проявлении фосфорномо-либденовой кислотой. Обработка парами аммиака позволила снизить предел обнаружения сапонинов в последнем случае до 0,2 мкг в пробе.

         Количественное определение сапонинов методом ТСХ с использованием сканирующей денситометрии проводили на пластинах "Армсорб" (скорость хроматографирования в этом случае в 2 раза выше) или "Сорбфил", во II и III элюирующей системе (как содержащих менее токсичные компоненты). Детектирование зон осуществляли 10 % раствором фосфорномолибденовой кислоты. Объем наносимой пробы не более 5 мкл, высота подъема фронта элюента — 6 см, время элюирования 30 - 60 мин. Длина волны при сканировании λ = 675 нм. После обработки пластин сапонины аралии и сахарной свеклы проявляются в виде трех зон разной интенсивности.

Общий вид денситограмм, полученных при сканировании, представлен на рис. 1.

Сравнение хроматограмм сапонинов, выделенных из таблеток "Сапарал" (рис. 1, а) и "Настойки аралии" (рис. 1,6) позволяет отметить различное соотношение 44

аралозидов А, В и С, входящих в состав этих лекарственных форм. Подобное непостоянство соотношения индивидуальных сапонинов в сырье в зависимости oт условий произрастания растения отмечалось и ранее. Соотношение сапонинов в готовых лекарственных формах легко оценить при помощи полученных денситограмм. Поскольку на хроматограмме обнаруживается 3 зоны, соответствующие сапонинам, а на денситограмме, соответственно, три пика, при построении градуировочной зависимости площади всех пиков суммировали. Ошибка в этом случае была ниже, чем при проведении расчетов по параметрам пика одного из компонентов, учитывая непостоянство их соотношения (рис. 2).

 

 

Рис. I. Денситограммы, полученные при сканировании ТСХ-пластин: а — сапонины аралии, выделенные из таблеток “Сапарал”; 6 — сапонины настойки аралии; в — сапонины сахарной свеклы. Суммарное содержание сапонинов в пробе — 5 мкг. А, В, С— пики сапонинов; 0 — линия старта; f— линия фронта.

 

 

Рис. 2. Градуировочная зависимость  суммы площадей пикон сапонинов  на хроматограмме от их содержания в пробе. / — сапонины аралии; 2 — сапонины сахарной свеклы. По оси абцисс — солержание сапонинов в пробе (мкг), по оси ординат —сумма площадей пиков (см²).

 

 

          Градуировочную зависимость суммы площадей пиков на денситограмме от содержания вещества в пробе получали хроматографированием серии стандартных растворов с известным содержанием сапонинов. Исходный раствор готовили растворением в 80 % этаноле точной навески сапонинов, высушенной до постоянной массы. Серию рабочих растворов готовили последовательным разбавлением исходного 80% этанолом. Содержание сапонинов в них составляло 0,04 - 2,0 мг/мл (0,2 - 10 мкг в пробе при объеме пробы 5 мкл). Этот концентрационный диапазон можно считать оптимальным при сканировании. Минимальное содержание сапонинов, определяемое этим методом, составляет 0,2 мкг/пробе. Относительное стандартное отклонение в этом случае не превышает 0,03.

            Полученные градуировочные зависимости имеют нелинейный характер, что полностью согласуется с теорией Кубелки - Мунка, учитывающей поглощение и рассеивание света сорбентом. В узком диапазоне малых концентраций зависимости можно рассматривать как линейные (0,2 - 2,0 мкг/пробе). Нелинейная часть кривых может быть линеаризована переводом количества вещества в пробе и площади пика в обратные величины и приобретает вид, представленный на рис. 3.

Рис. 3. Зависимость обратной величины суммы площадей пиков сапонинов на хроматограмме (1/S • 10^-1) от их обратной величины содержания в пробе (1/m - 10^-1). 1 —сапонины аралии; 2 — сапонины сахарной свеклы.

 

          При помощи полученной градуировочной зависимости определяли содержание сапонинов в настойке аралии. 5мл настойки разбавляли 70% этанолом в мерной колбе емкостью 25 мл. 5 мкл полученного раствора наносили на стартовую линию пластаны ''Армсорб". В соседнюю точку наносили 5 мкл стандартного раствора аралозидов с концентрацией I мг/мл (5 мкг в пробе). Пластинки обрабатывали, как описано выше.

Отличие полученных результатов от результатов определения по ФС 42-1647-93 (5,3 мг/мл) составило 6 — 7 % в сторону завышения, что может быть объяснено потерями сапонинов при проведении многостадийной предподготовки пробы по ФС (таблица).

Описанным выше способом были проведены  определения сапонинов в таблетках "Сапарал" и в растительном сырье (корнях аралии маньчжурской и корневищах сахарной свеклы) с предварительной исчерпывающей экстракцией сапонинов из таблеток из сырья — 80 % горячим этанолом. Отклонения от результатов определения по ФС 42-1755 - 81 для таблеток (0,040 г) находятся в тех же пределах, что и для настойки (таблица).

           Таким образом показана возможность экспрессного количественного определения некоторых тритерпеновых сапонинов, производных олеаноловой кислоты в фармпрепаратах и растительном сырье методом ВЭТСХ с последующей количественной оценкой полученных зон с использованием сканирующей денситометрии.

Результаты определения достаточно хорошо коррелируют с результатами определения по ФС. Методика позволяет сочетать определение подлинности препаратов методом ТСХ (по ФС) с последующим сканированием зон компонентов на пластинах и их количественной оценкой. Хроматограммы, полученные при сканировании, позволяют определить также соотношение индивидуальных сапонинов в анализируемых объектах.

 

Результаты количеетвевного  определения аралозндов в на-CTofik-c аралии (I) и таблетках "Сапарал" (2) методом ТГХ с использованием сканирующей дснсптоиетрнн /' = 0,95, и - 5, /=2,78,/=4

Метрологические характеристики	1	2
<X>	5.66	0.043
S	0.23	0.002
S<X>	0.1!)	O.OOS4
ΔX	0,64	0,0056
Δ<Х>	0.28	0.0025
ε	11.30	0.1302
<ε>	4,95	0,0581

 

ИЗУЧЕНИЕ  ЛИПИДНОГО И ФЛАВОНОИДНОГО СОСТАВА ОБРАЗЦОВ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА ЧИНА (Lathyrus.)

 

          Из многих представителей семейства Бобовые, такие как люцерна, люпин клевер, вика были выделены флавоноиды, обладающие широким спектром действия: противовоспалительным, ранозаживляющим, со-судоукрепляющим и т.д. Из красного клевера были выделены изофлавоны: биоханин А — 0,8 % и формо-нонетин — 0,78 %, обладающие эстрогенной активностью .

          Нами изучался флавоноидный состав в отдельных видах рода чина: ч.посевная (I), члуговая (II), ч.весенняя (III), ч.лесная (IV).

         С целью возможного использования липидного комплекса в пищевых добавках и лекарственных препаратах нами также изучался полный фракционный состав липидов в траве и семенах чины.

Материалы и методы

          Выделение липидной фракции из сухого сырья проводили по методу Блая и Дайера.

К навеске (0,2 г) сухого растительного  сырья добавляли 1,6 мл дистиллированной воды и выдерживали в течение суток на холоду. Затем добавляли 6 мл смеси хлороформ — метанол (1 :2) и оставляли на 3 суток, после чего центрифугировали при 8 тыс. об/мин — 15 мин. К прозрачному супернатанту добавляли 2 мл воды и 2 мл хлороформа. Образовавшуюся 2-х фазную систему разделяли в делительной воронке. Хлороформный слой дважды промывался метанолом и упаривался досуха на роторном испарителе. Остаток сушили в вакуум-эксикаторе, затем разбавляли хлороформом до концентрации 10 мг/мл и раствор хранили в стабилизированном хлороформе при + 4°С.

Качественный анализ липидной фракции  проводили с использованием метода ТСХ на пластинах Кизельгель 60 (254) в следующих системах растворителей:

  А. Для нейтральных липидов: 1) Гексан — бензол (9:1) [4]; 2) Гексан — эфир — уксусная кислота (90:10:1) [5].

  Б. Для полярных липидов (фосфолипидов): 1) хлороформ — ацетон — метанол — уксусная кислота — вода (6:8:2:2:1), кислый; 2) хлороформ — мета-

нол — 26% аммиак (65:25:5), основной; 3) хлороформ — метанол — вода (65:25:4), нейтральный.

           При определении качественного состава фосфолипидов их идентификация проводилась с использованием различных проявителей (пары йода, нингидрин, реактив Драгендорфа, серная кислота) и с помощью R_f стандартов.

           Вышеперечисленный набор систем и реактивов позволил исчерпывающе провести анализ липидных фракций, выделенных из образцов чины.

           Для изучения флавоноидного состава с учетом фаз вегетации были выбраны следующие образцы: I (фаза цветения); IV (фаза цветения); III (сочевичник) фаза бутонизации; II (фаза цветения); II (фаза плодоношения); II (фаза вегетации до цветения).

Выделение флавоноидов из сухого сырья  проводилось по методике, обеспечивающей их исчерпывающую экстракцию.

           С этой целью, 1 г измельченной травы помещали в колбу с обратным холодильником, заливали 20 мл 70 % этанолом и кипятили в течение 20 мин на водяной бане. Экстракт охлаждали, фильтровали через стеклянный фильтр Шотта и упаривали досуха на роторном испарителе. Остаток растворяли в спирте этиловом до конечной концентрации вещества 10 мг/мл. Определение суммарного содержания флавоноидов проводилось с использованием рутина в качестве стандарта. Результаты этого исследования приведены в табл. 3.

            Определение качественного состава флавоноидов проводилось методом ТСХ на пластинках Кизельгель 60(254) фирмы Мерк, в системе растворителей н-бутанол — уксусная кислота — вода (6:1:2). Обнаружитель — серная кислота при УФ (254 нм) — пятна флавоноидов сиреневого цвета на зеленом фоне.

Таблица 1

Суммарное содержание флавоноидов в сырье (трава) различных видов чины (в %, в пересчете на абсолютно сухую массу)

№ п\п	Вид чины	Содержание суммы флавоноидов (%)
1	I, фаза цветения	4,51
2	IV, фаза цветения	1,23
3	III, (сочевичник), фаза бутонизации	0,28
4	II, фаза цветения	3,56
5	II, фаза плодоношения	1,50
6	II, фаза вегетации. До цветения	1,25