Тонкослойная хроматография. Применение в фармации

Горизонтальная тонкослойная хроматография

 

          Этот метод  наиболее сложен в аппаратурном оформлении но наиболее удобен. Так, в хроматографической камере пластинка размещается горизонтально  и подача системы происходит на один край пластинки с помощью фитиля. Фронт растворителя движется в противоположную сторону. 
          Есть еще один прием, позволяющий предельно упростить камеру. Для этого хроматографическую пластинку на алюминиевой основе слегка изгибают и помещают в камеру. В данном случае система будет поступать с двух сторон одновременно. Для этой цели подходят только пластины с алюминиевой подложкой, так как пластиковая и стеклянная основа "несгибаема", т.е. не сохраняет форму. 
          К достоинствам этого метода можно отнести то, что в горизонтальной кювете  насыщение парами системы происходит гораздо быстрее, скорость движения фронта постоянная. А при хроматографировании с двух сторон, фронт не "убегает"

Радиальная тонкослойная хроматография.

 

          Радиальная тонкослойная хроматография заключается в том, что в центр пластинки наносится исследуемое вещество и туда же подается система, которая движется от центра к краю пластинки.

Сушка пластин.

 

          После процесса разделения исследуемых веществ, пластинки  сушат. Это тоже немаловажный процесс, так как при наличии на пластинке даже следов растворителя, возможно получить неправильные результаты хроматографирования. 
          Если хроматографическая система имела в своем составе только легкокипящие компоненты, то достаточно естественной сушки в течении 3-5 минут. Если же в состав системы входят высококипящие жидкости (спирты, вода, органические кислоты и т.д.), сушку пластин нужно проводить не менее 10 мин или помещать пластинку в сушильный шкаф.

Идентификация разделенных веществ.

 

          Высушенная  пластинка является хроматограммой исследуемых веществ. Если вещества являются окрашенными, то идентификация  начинается с определения цвета  разделенных веществ. 
          Но в большинстве случаев разделяемые вещества бесцветны и простое визуальное сравнение невозможно. 
          Для тонкослойной хроматографии существует несколько видов качественного анализа (идентификации) разделенных веществ:

• Визуальные методы и определение Rf разделенных веществ.
• Цветные реакции.
• Сравнение со свидетелями.
• Физико-химические методы идентификации.

Рассмотрим подробнее каждый вид  качественного анализа в тонкослойной хроматографии.

Физические методы

 

           Визуальные  методы используются в основном, для определения местоположения  пятен разделенных веществ на хроматографической пластинке. Для этого пластинку рассматривают как в видимом свете, так и используя ультрафиолетовый свет (в основном свет с длиной волны 366 и 254 нм) 
           Это первый этап идентификации, на котором определяется качество подобранных условий и полученных результатов хроматографирования. 
           Так, определив качество хроматографирования (отсутствие "хвостов" разделяемых веществ или перекрытие их пятен, правильную форму и размеры, отсутствие слияния хроматографических дорожек и т.д.) и признании пригодным проведенного разделения для дальнейшего исследования, определяют Rf выявленных пятен.

Значение Rf.

 

           Одним из  основных показателей в ТСХ  является показатель Rf. Этот параметр  является аналогией времени удерживания  и зависит как от свойств разделяемых веществ, состава подвижной фазы и сорбента, так и от физических параметров. 
           Определение значения Rf проводят как отношение расстояния прошедшего веществом к расстоянию, прошедшего фронтом растворителя

Rf = L/L₀           

  Значение Rf - величина безразмерная  и имеет значение от 0 до 1. Однако  в литературе нередко встречается  такие показатели как hRf, Rf×100, которые являются тем же Rf, но  умноженными на 100, для того, чтобы  не оперировать десятичными значениями. 
           На значение Rf не влияет расстояние пройденное фронтом растворителя, однако во многих методиках описывается прохождение фронта на расстояние 10 см. Это используется только для облечения расчетов Rf. 
           На практике, в начале определяют расстояние прошедшее фронтом растворителя: от линии старта (а не от края пластинки) до места, где находился фронт в момент окончания хроматографирования. Затем определяют расстояние от линии старта до пятна разделенного вещества. Во тут и оказывает влияние размер пятна! Ведь если пятно имеет круглую форму и небольшой размер, то полученное Rf имеет четкое значение. А если полученное пятно имеет большой размер или неправильную форму, то при определении Rf такого пятна, ошибка может достигнуть 0,1! 
           В случае распределительной хроматографии коэффициент распределения вещества и его Rf связано соотношением:

где Sп и Sн -площади поперечных сечений подвижной и неподвижной фазы. 
           Как мы видим, Коэффициент распределения, при постоянном отношении Sп/Sн есть величина пропорционально зависящая от Rf , и может быть определена через него.

Цветные реакции.

 

 

           Цветные реакции  в тонкослойной хроматографии  используются чрезвычайно широко. Они служат не только для определения местоположения разделенных компонентов (обработка серной кислотой, парами йода), но и определения как класса веществ, так  и идентификации (при наличии индивидуальных реакций). 
           Мы не будем здесь рассматривать это огромное разнообразие цветных качественных реакций, скажем лишь, что при совпадении всех качественных реакций и совпадении полученных значений Rf вещества в трех различных системах с литературными данными, вещество идентифицировано. Хотя, на мой взгляд, необходимо дополнительное подтверждение исследованием другим физико-химическим методом.

Сравнение со свидетелем.

 

           При проведении  исследований веществ с предполагаемым  составом, применяют метод хроматографирования  со свидетелем - известным веществом. Этот метод используется кода трудно выдержать условия хроматографирования, нет литературных данных Rf для данной системы или адсорбента, использование градиентного метода и т.д. Да и при проведении цветных реакций можно сравнить не только цвета, но и оттенки исследуемых веществ и свидетелей, что также немаловажно. 
           С другой стороны этот метод требует дополнительных расходов на свидетели.

Физико-химические методы идентификации.

 

           Прелесть  тонкослойной хроматографии состоит в том, что после хроматографирования каждое разделенное вещество можно в дальнейшем исследовать другими методами гораздо проще. И дело тут не в том, что другие методы хроматографирования не могут этого. Дело тут в сложности выделения и материальных затратах на специальные приспособления, у которых только одна задача - выделить вещество. 
           В тонкослойной хроматографии есть только одна трудность - снять слой сорбента и вымыть из него вещество. В дальнейшем можно его исследовать с использованием ИК и УФ-спектрометрии, рентгено-структурными методами, ЯМР и т.д. 
           Поэтому, используя тонкослойную хроматографию для разделения смесей, можно не только исследовать каждый компонент различными методами, но и наработать небольшое количество, в том числе и для свидетелей.

Методы количественного  анализа

 

          Количественный  анализ в тонкослойной хроматографии  имеет несколько видов, характеризующий  каждый этап развития метода. И хотя некоторые методы можно применять  только как полуколичественные, они до сих пор применяются на практике.          

 Метод визуального сравнения. Как говорилось выше, интенсивность окраски пятна и его размер от количества хроматографируемого вещества. Поэтому визуальное количественное определение построено на нескольких приемах. 
          Метод разбавления. Этот метод заключается в том, что для каждого вещества определяют предельную концентрацию, при которой вещество не может быть определено хроматографическим методом. При хроматографировании исследуемого вещества поводят разбавление до тех пор, пока оно перестает проявляться на пластинке.  
          Содержание вещества С, определенное таким методом находят по формуле:

C=an

где n-разбавление, а-концентрация вещества, при котором оно не проявляется при хроматографировании. 
          Метод определения площади пятна. Если наносить одинаковые объемы исследуемых веществ и свидетелей, то получившиеся после хроматографирования площади пятен пропорциональна логарифму концентрации вещества. S= alnc + b

где а и b - эмпирические коэффициенты, определяемые экспериментальным  путем. 
          Если пятно разделенного вещества имеет резкие границы, то площадь пятна можно определить весовым методом (вырезать пятно и взвесить), замеряется планиметром. Этот метод дает ошибку до 10-15%. 
          Однако он имеет ряд существенных недостатков. Первый и самый существенный в том, что таким образом можно определять концентрацию окрашенных веществ или имеющих флуоресценцию в УФ области (254, 366 нм). Этот недостаток можно устранить добавлением  в сорбент различных люминофоров, то при этом увеличивается погрешность определения. 
          Обработка пластин проявляющими веществами (реактивами) также может быть использована (например использование фильтровальной бумаги пропитанной проявляющим реагентом с последующим контактом с хроматографической пластинкой и дальнейшим определением на ней площади проявленного вещества), но погрешность определения также высока. 
          Необходимость более достоверного результата количественного определения привела к использованию инструментальных методов. 
          Метод элюирования. Этот метод заключается в том, что разделенное вещество смывают с сорбента растворителем и определяют его концентрацию уже другими методами - фотометрическими, полярографическими и т.д. Это достаточно точный метод, но только при условии количественного выделения разделенного вещества. Из-за высокой трудоемкости метод используется достаточно редко и неприемлем при большом количестве исследуемых образцов. 
          Фотографический метод определения заключается в фотографировании пластинок с разделенным веществом и дальнейшим определением степени почернения, с использованием десинтометров. 
          Радиографический метод аналогичен фотометрическому, только с той разницей, что определяется почернение пластинки, вызванное излучением разделенного вещества. Этот метод используется только при определении веществ с меченными атомами. 
          Фотодесинтометрический метод может быть использован без выделения вещества с пластинки и основан на определении не только площади пятна, но и его интенсивности. 
          Это наиболее точный метод определения концентрации веществ, так как позволяет при использовании калибровочных графиков, проводить достаточно точные количественные определения всех разделенных веществ (до 2-10%) непосредственно на пластинке за короткий промежуток времени. 
          Неудивительно, что при развитии тонкослойной хроматографии, применение десинтометров увеличивается, чувствительность и, следовательно, точность определения концентрации разделенных веществ повышается и приближается к точности высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Рис. 1. Типичная камера для проявления хроматографической пластинки с тонким слоем

1. крышка 
2. стеклянная камера
3. пластинка ТСХ
4. сорбент
5. место нанесения пробы
6. растворитель

Типичная ТСХ хроматограмма  метиловых эфиров жирных кислот.

На хроматограмме FAME = fatty acids methyl esters = метиловые эфиры жирных кислот. Start = точка нанесения разделяемых смесей.

Хроматограмма выполнена  на пластинке Sorbfil. Система - бензол. Проявление - обугливание после опрыскивания серной кислотой.

Точка 1 - метиловые эфиры жирных кислот. Точка 2 - продукты метилирования общих липидов.

Стрелкой показано направление движения фронта растворителя (системы). Фронт растворителя при хроматографировании двигался до верхнего края пластинки.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Применение  метода ТСХ в фармации

 

         Большое  значение хроматографических методов  для фармации связано с тем,  что при  производстве лекарств  во многих случаях требуется  предварительное выделение природных  или синтетических продуктов  в чистом виде. Проведение анализов также часто основано на разделении смесей на компоненты. Рассмотрим два примера применения метода ТСХ, доказывающих его значимость в анализе и производстве лекарственных веществ.

 

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ  ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИТЕРПЕНОВЫХ САПОНИНОВ  МЕТОДОМ ВЭТСХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СКАНИРУЮЩЕЙ ДЕНСИТОМЕТРИИ

         Тритерпеновые  сапонины (гликозиды) являются действующимн  веществами многих лекарственных  препаратов.

         Большая  часть применяемых в настоящее  время методик количественного определения тритерпеновых сапонинов основана на кислотном гидролизе последних с дальнейшим определением агликона чаще всего титрометрическими, реже — спектральными методами анализа.

         Подобные  методики, основанные на разрушении  молекул сапонинов, имеют ряд  недостатков. Они длительны, не позволяют количественно оценить соотношение индивидуальных сапонинов в суммарных сапонинсодержащих препаратах.

         В большинстве  случаев авторы ограничиваются, как правило, качественной оценкой,  используя метод ТСХ, наиболее  доступный и простой хроматографическнй метод анализа. Применение ТСХ для определения количественного содержания компонентов сдерживается отсутствием сканирующих денситометров.