Автор работы: Пользователь скрыл имя, 09 Марта 2014 в 17:21, шпаргалка
Работа содержит ответы на вопросы для экзамена (зачета) по "Геномике"
48. Проект по
расшифровке генома человека бы
49. Особенности исследований геномов высших растений. Геном Arabidopsis thaliana. - Oryza sativa. Populus trichocarpa. Особенности исследования геномов высших растений: 2 направления: клонирование и секвени-рование геномов; изучение геномов на базе сравнительной геномики. Секвенирование геномов основано на двух мето-дических подходах. Первый подход: разбиение геномов на части и получение генетических молекулярных маркеров. После постепенного изучения различных участков хромосом их клонируют, секвенируют отдельные клоны и вставляют локальные контиги. Конечный этап состоит в установлении полной нуклеотидной последовательности участков хромосом и целых хромосом. Второй подход: одномомент-ное разбиение генома на части: клонирование полученных фрагментов в одном из вирусных векторов; получение зна-чительного числа клонов; их частичное секвенирование и составление контига; установление полной последователь-ности нуклеотидов в геномной ДНК. Геном Arabidopsis thaliana: это первый секвенированный геном растения. В геноме содержится 35 % ГЦ-пар. Количество экзонов на 1 ген 5,14 при среднем размере экзона 251 тыс п.н. средний размер интрона 169 п.н. протеом включает 25 498 белков, а одна хромосома в среднем кодирует 5100 белков. В геноме содержится также около 80 хлоропластных и 60 митохон-дриальных генов, кодирующих белки. Геном Oryza sativa: геном составляет около 430 мпн. Общее число генов, вклю-чая мигрирующие элементы составило 37 664 гена. Геном Populus trichocarpa: геном составляет около 480 млн пар оснований, распределенных в 19 хромосомах.
50. Причины наиболее существенных отличий геномов растений от геномов животных. Изучение геномов растений - задача значительно более сложная, чем исследование генома человека и других животных. Это связано со следующими обстоятельствами: • огромными размерами геномов, достигающими для отдельных видов растений десятков и даже сотен миллиардов пар нуклеотидов (п.н.): геномы ос-новных хозяйственно важных растений (кроме риса, льна и хлопка) по размерам либо близки к геному человека, либо превышают его во много раз; • резкими колебаниями числа хромосом у различных растений - от двух у некоторых видов до нескольких сотен у других, причем не удается выявить строгой корреляции м/у размером генома и числом хромосом; • изобилием полиплоидных (содержащих более двух геномов на клетку) форм с близкими, но не идентич-ными геномами (аллополиплоидия); • чрезвычайной обога-щенностью геномов растений (до 99%) "незначащей" (неко-дирующей, то есть не содержащей генов) ДНК, что резко за-трудняет стыковку (расположение в правильном порядке) отсеквенированных фрагментов в общий крупноразмерный участок ДНК (контиг); • неполным (по сравнению с геномами дрозо-филы, человека и мыши) морфологическим, гене-тическим и физическим картированием хромосом; • практи-ческой невозможностью выделять в чистом виде индивиду-альные хромосомы с помощью методов, обычно применяе-мых с этой целью для хромосом человека и животных (сор-тировка в потоке и использование гибридов клеток); • труд-ностью хромосомного картирования (определение располо-жения на хромосоме) отдельных генов с помощью гибриди-зации in situ, обусловленной как высоким содержанием в ге-номах растений "незначащей" ДНК, так и особенностями структурной организации хромосом растений; • эволюцион-ной отдаленностью растений от животных, что серьезно осложняет использование для изучения геномов растений сведений, полученных при секвенировании генома человека и других животных; • длительным процессом размножения большинства растений, что существенно замедляет их гене-тический анализ.
51. Эволюция геномов. В историч. плане вопрос об эволю-ции генов является важнейшим, т.к. эволюция генов связана с истоками жизни вообще и ее совершенствованием в част-ности. Поск-ку выявлена изначальная роль в происхождении жизни РНК, то предполагают, что начало эволюции генов датируется 3,5-4 млрд лет назад, когда сформировались пер-вые мол. РНК, кот. каким-то образом детерминировали синтез белков, т. е. были первыми хранителями ген. информации. Но когда выявилась необходимость в повышении эффективности синтеза белков, способность кодирования ген. информации перешла к ДНК, кот. стала главным хранителем ген. информации. Что касается РНК, то она оказалась м/у ДНК и белком, став «переносчиком» информации. Конечно, эта гипотеза не имеет доказательств. Тем не менее многие далее считают, что появление ДНК связано с усложнением стр-ры клеток и необходимостью кодирования большого кол-ва информации по сравнению с РНК. Другими словами, с началом участия ДНК в хранении ген. информации стал развиваться ген. код. В последнее время большое внимание приобрела гипотеза, в соотв. с кот. источником новых генов явл-ся рекомбинация эксонов, а также транспозоны, поступающие в геномы орг-мов. Особый интерес в эволюц. плане представляет ДНК, кот. не транскрибируется (эгоистическая ДНК). Казалось, должны быть какие-то факторы контрселекции, которые обеспечивают поддержание этой ДНК в клетках. Но такие факторы неизвестны. Тем не менее очень популярно предположение, что эгоистическая ДНК тоже является источником образования новых генов. В обсуждении направления эволюции геномов известно два объяснения. Одни ученые предполагают, что увеличение геномов клеток в процессе эволюции орг-мов шло путем включения в ядерные стр-ры дополнит. копий генов, в то время как другие считают, что в эволюции шла дупликация уже образованных генов с последующей их дивергенцией. Док-ва включения генов в геномы отсутствуют, тогда как предположение о дупликации и дивергенции генов имеет существенные обоснования, причем эти обоснования исходят из данных о том, что многочисленные семейства белков кодируются наборами родственнных генов. Псевдогены - нефункциональные аналоги структурных генов, утратившие способность кодировать белок и не экспрессирующиеся в кл. Термин «псевдоген» предложен в 1977 году. Некоторые псевдогены могут копироваться из мРНК и включаться в хромосомы, такие посл-ти наз-ся процессиро-ванными псевдогенами (ретропсевдогенами). Тем не менее, они также нефункциональны. Псевдогены происходят от обычных функциональных генов, но утрачивают способ-ность экспрессии в рез-те мутаций (появление стоп-кодонов, сдвиг рамки считывания и т. п.).Число процессированных псевдогенов (ретропсевдогенов) в среднем больше, чем предковых функциональных генов. Иногда число процесси-рованных псевдогенов может превосходить число соответ-ствующих функциональных генов на несколько порядков. Один из примеров - семейство Alu-повторов, содержащих характерный сайт рестрикции Alu1-эндонуклеазы. Анализ ген. посл-ти псевдогенов и сравнение их с предковыми ге-нами м. б. использовано при изучении родственных связей м/у различными видами живых существ и их происхожде-ния. При анализе последовательностей нуклеоти-дов в ДНК и АК в белках принято различать ортоло-гию и паралогию. Гомологичные посл-ти назыв. ортоло-гичными, если к их разделению привел акт видообразования: если ген существует у некоего вида, кот. дивергирует с образованием двух видов, то копии этого гена у дочерних видов называются ортологами. Гомологичные последова-тельности называют паралогичными, если к их разделению привело удвоение гена: если в пределах одного организма в рез-те хромосомной мутации произошло удвоение гена, то его копии называют паралогами. Ортологи обычно выпол-няют идентичные или сходные функции. Это не всегда справедливо в отношении паралогов. В виду отсутствия давления отбора на одну из копий гена, подвергшегося удвоению, эта копия получает возможность беспрепят-ственно мутировать далее, что может привести к возникно-вению новых функций.
52. Повторяющиеся последовательности в геномах про-кариот. Классификация повторов.
В качестве первичной классификации повторов можно представить следующую. По ориентации частей повторов их можно разделить на прямые (DR) и обращённые (IR).
По длине их можно разделить на короткие (SSR) и длинные (LR). По расположению друг относительно друга их можно разделить на прилежащие или смежные (contiguous) и диспергированные (interspersed или SPIDR - Spacer interspersed direct repeats), иногда употребляется термин близкие повторы (СR). Одна из разновидностей первых – тандемные повторы (TR). По расположению относительно генов их можно разделить на внутригенные (intragenic) и межгенные (intergenic). По степени связи с другими структурами повторы можно разделить на автономные или диспергированные (FR – free repeats) и связанные с генами или элементами (EAR – element-associated repeats).
53. Повторяющиеся послед-ти геномной ДНК эукариот. Геном эукариот хар-ся 2 основными особенно-стями: 1) Повторенность последовательностей; 2) Разделе-нием по составу на различные фрагменты, характеризуемые специфическим содержанием нуклеотидов; Повторенная ДНК состоит из нуклеотидных посл-тей различной длины и состава, которые встречаются в геноме несколько раз либо в тандемно-повторенном, либо в диспергированном виде. По-следовательности ДНК, которые не повторяются, называются уникальной ДНК. Размер части генома, занятой повторя-ющимися последовательностями, широко варьирует м/у таксонами. У дрожжей он достигает 20%, у млекопитающих до 60% всей ДНК повторяется. У растений процент повто-ренных последовательностей может превышать 80%. По взаимной ориентации в структуре ДНК различаются прямые, инвертированные, симметричные повторы, палиндромы, комплементарные палиндромы и т.п. В очень широком диапазоне варьирует и длина (в числе оснований) элемен-тарной повторяющейся единицы, и степень их повторяемо-сти, и характер распределения в геноме; периодичность по-вторений ДНК может иметь очень сложную структуру, когда короткие повторы включены в более протяженные или окаймляют их и т.д. Ставшая классической работа Бриттена и Кона по кинетике ренатурации ДНК показала, что геномы высших эукариот можно грубо разделить на четыре фракции: самокомплементарная ДНК, высоко повторенная ДНК, умеренно повторенная ДНК и уникальные последова-тельности. Самокомплементарная ДНК сост. из палиндром-ных посл-тей, способных образовывать двуцепочечные шпильки, "замыкаясь" сами на себя. Фракция высоких по-второв сост. из коротких посл-тей длиной от нескольких нуклеотидов до нескольких сотен н.п., которые имеют около 500,000 копий. В умеренные повторы входят более длинные последовательности от сотен до тысяч н.п., имеющие до 100 копий на геном. Поиск, классификация и в дальнейшем вы-явление функции повторов- необходимый этап при анализе геномов. Повторы могут быть точными и неточными. Кроме того, для посл-тей ДНК можно рассматривать зеркальные и инвертированные повторы. С биолог. точки зрения интерес-ны также неточные повторы. Такие повторы иногда назы-ваются вырожденными. Дупликации. Повторы в геномных последовательностях были обнаружены довольно давно. Подробную сводку ранних сведений можно найти в кни-ге Газаряна и Тарантула. Повторы в геномах можно класси-фицировать по-разному: 1) Некоторые геномы сами являются дупликациями. 2) Сегментарные дупликации, особенно выраженные в геноме человека. Такие дупликации включают перенос 1-200 т.п.о. блоков геномных последовательностей в основном в прицентромерные и в меньшей степени в субтеломерные районы хромосом. Степень гомологии таких дупликаций выше 90%. Некоторые из этих дупликаций свя-заны с геномными болезнями. Сегментарные дупликации занимают 3.3% генома человека ( IHGSC, 2001 , Venter et al., 2001 ). 3) Дупликации генов и генные семейства. 4) Множе-ственные копии мобильных элементов. 5) Простые повторы (короткие, от 1 до нескольких десятков нуклеотидов, в том числе микросателлиты и минисателлиты , которые не коди-руют никаких продуктов. 6) Палидромы. 7) Блоки тандемно повторенных последовательностей, такие как последова-тельности в центромерах, теломерах, коротких плечах акро-центрических хромосом, кластеры рибосомальных генов. 8) Инактивированные ретротранспозированные копии генов. 9) Внутрибелковые повторы ( Heringa, 1998 ). По частоте встречаемости различают низкокопийные (примерно до 10 копий), умеренно повторяющиеся посл-ти (от 10 до 104), ча-сто повторяющиеся последовательности (более 105). По типу следования различают диспергированные и тандемные повторы.
54. Мобильные генетические элементы плазмид, бакте-рий и эукариот. Мобильные генетические элементы про-кариот: IS-элементы, транспозоны. Для бактерий и плазмид характерны мобильные элементы с короткими или длинными инвертированными повторами (ИП). Длина дуплициро-ванных прямых повторов (ДПП), как правило, 5 или 9 п.н. Бактериальные мобильные элементы можно разделить на две основные группы: 1. IS-элементы: небольшие (размером не более 2,5 т.п.н.) элементы, которые состоят из центральной части с геном транспозазы, фланкированной двумя ин-вертированными повторами. 2. Собственно транспозоны, которые несут, кроме транспозазы, другие гены, не имеющие отношения к транспозиции (чаще всего гены устойчивости к антибиотикам). Собственно транспозоны можно в свою очередь разделить на следующие группы 1) Сложные транспозоны (семейство Tn3) – короткие ИП на концах, де-лают в ДНК-мишени ДПП из 5 п.н. и перемещаются по ме-ханизму репликативной транспозиции. 2) Составные транс-позоны (Tn5, Tn9, Tn10) с длинными ИП, представляющими собой различные IS-элементы. Длина ДПП обычно 9 п.н.
Мобильные элементы эукариот значительно разнообразнее прокариотических элементов. У эукариот распространены разнообразные мобильные элементы как прокариотического типа, так и элементы, встречающиеся только у эукариот, – ретроэлементы или ретротранспозоны. Элементы прокари-отического типа с короткими ИП (класс II.1) характерны для растений и дрозофилы. Элементы с длинными ИП (класс II.2) у эукариот встречаются редко. Элементы с короткими ИП (класс II.1) содержат транспозазу и перемещаются путем нерепликативной транспозии, но отличаются прокариоти-ческих мобильных элементов некоторыми особенностями, специфичными для эукариотических элементов, например, наличием у многих из них интронов. ДНК-транспозоны эу-кариот делают ДПП различной длины, специфичной для каждого элемента.
55. Молекулярные механизмы транспозиции: консерва-тивная и репликативная транспозиция, транспозиция двух классов ретротранспозонов. Репликативная транспозиция отличается тем, что мобильный элемент, перемещаясь в другую молекулу, оставляет свою копию в исходной ДНК. Это может произойти только за счет удвоения (репликации) элемента. При репликативной транспозиции на концах подвижного элемента происходят разрывы с образованием выступающих 3’-OH-концов. Одновременно транспозаза делает разрывы в ДНК-мишени. 3’-OH-концы подвижного элемента ковалентно связываются с 5’-Р-концами мишени, и образуется структура с двумя вилками репликации на концах подвижного элемента. В вилках репликации инициируется синтез ДНК (направленный «внутрь»). В результате образуется две копии мобильного элемента. При этом образуется коинтеграт). Коинтеграты разрезаются на 2 ре-пликона в рекомбинационном res-сайте ферментом резол-вазой. Старая и новая копии мобильного элемента в коинте-грате находятся в одной ориентации, и разрешение коинте-грата идет через сложную фигуру, напоминающую восьмер-ку. В результате снова образуется 2 репликона, но теперь каждый из них несет копию мобильного элемента. Реакция относится к сайт-специфической рекомбинации. Реплика-тивный механизм транспозиции распространен сравнительно мало. Он обнаружен у мобильного элемента Is6, фага Mu и бактериальных транспозонов семейства Tn3 с короткими ИП. Консервативная транспозиция заключается в вырезании элемента и его перемещении в новое место. При этом 2 молекулы транспозазы связываются с концами мобильного элемента и делают разрывы одновременно в обеих цепях ДНК на концах мобильного элемента и в ДНК-мишени. Далее транспозаза сводит вместе концы мобильного элемента и ДНК-мишень, 3-OH-концы элемента соединяются с 5-Р-концами ДНК-мишени, а м/у 3’-OH-концами ДНК-мишени и 5’-Р- концами элемента образуется брешь, которая запол-няется с помощью репаративного синтеза ДНК, в результате чего на концах мобильного элемента возникают ДПП строго фиксированной длины. В исходном репликоне остается ДНР. Будет ли он репарирован – зависит хозяйской клетки.Этот механизм характерен для большинства мобильных элементов бактерий и эукариотических элементов с короткими ИП. По такому типу перемещаются многие IS-элементы и мобильные элементы, которые называют составными: Tn5, Tn9, Tn10 и другие. Составные транспозоны отличаются тем, что у них инвертированные повторы представлены IS-элементами, которые находятся в обратной или (гораздо реже, например, Tn9) в прямой ориентации. У эукариот широко распространены ретротранспозоны, в транспозициях которых задействованы фермент обратная транскриптаза (ревертаза) и РНК-копия элемента в качестве интермедиата. Ретроэлементы подразделяются на 2 группы: 1)Ретротранспозоны с длинными прямыми концевыми повторами (ДКП) (класс I.1). Их структура соответствует ДНК-копиям геномов ретровирусов позвоночных, которые также являются мобильными элементами. 2)Ретроэлементы (класс I.2), не содержащие повторов на концах (некоторые авторы используют для них название «ретропозоны»).
56. Транспозоны бактерий (ТпЗ, Tn5, Мu). Группа мо-бильных элементов бактерий содержит в центральной части гены, не имеющие отношения к транспозиции, чаще всего это факторы устойчивости к АБ, лек. в-вам и ядам. Такие элементы при их открытии получили название транспозонов (Tn). Позднее так стали называть все мобильные элементы. Транспозон Tn3 представляет семейство мобильных эле-ментов с короткими ИП (инвертированные повторы (35-50 п.н.), перемещающимися с пом. репликативной транспози-ции и образующими ДПП из 5 п.н. У самого Tn3 центральная часть содержит гены транспозазы, резолвазы и бета-лактамазы bla (обеспечивает устойчивость к АБ пеницилли-нового ряда). Ген транспозазы tnA кодирует большой белок из примерно 1000 а.о., ген резолвазы tnR кодирует белок из 185 а.о. Гены транспозазы и резолвазы транскрибируются в противоположных направлениях с промоторов, располо-женных в межгенном пространстве длиной 170 п.н. В меж-генном пространстве находится и сайт res, по кот. происходит разрешение коинтегратов. Транскрипции генов резолвазы и транспозазы конкурируют друг с другом, и ген резолвазы выступает как ген-регулятор гена транспозазы. К семейству Tn3 относятся Tn1, Tn1000 и др. Транспозон Tn5 содержит терминальные инвертированные повторы , IS50, кот. ограничивают центральный район, кодирующий устойчи-вость к канамицину. Он дуплицирует последовательность длиной 9 н.п. в мишени во время инсерции. Точное выщеп-ление транспозона восстанавливает первоначальную после-довательность мишени и может быть зафиксировано на ос-нове реверсии инсерционных мутантов. Изучение мутантных элементов показало, что для выщепления не требуется транспозаза. Следовательно, выщепление не является отме-ной транспозиции (кот. требует транспозазу) и выполняется целиком хозяйскими функциями. Для эффективной транспо-зиции фага Mu требуются кодируемые фагом белки (A и B) и, как минимум, один хозяйский фактор (HU). Кроме того, требуется последовательность около 150 н.п. с левого и 50 н.п. с правого конца фага. Неотъемлемыми особенностями концов, по-видимому, являются терминальные пары осно-ваний и серии повторов консенсусной последовательности, являющейся сайтом связывания белка A. Белки A и HU вза-имодействуют с концами с целью сформировать нуклеопро-теиновую структуру (транспосому), которая опосредует надрезание на концах и, в присутствие белка B и АТФ, пе-ремещение нитей ДНК из Mu в ДНК-мишень Полученый промежуточный продукт транспозиции может возникнуть двумя путями. Фаг может быть реплицирован, что может генерировать коинтегратов м/у донорной и рецепторной по-следовательностями, или фаг может быть перенесен без ре-пликации из его первоначального местоположения, что дает увеличение количества простых вставок. Было найдено, что плазмиды, содержащие только один конец Mu (левый или правый), могут генерировать коинтегратов при условии присутствия белков A и B. Как и в случае семейства Tn3, ко- интеграты состояли из целой плазмиды-мишени и более од-ной целой донорной плазмиды. Один из стыков находился на Mu-конце донорной ДНК, а другой стык варьировал. Анализ последовательностей 12 варьирующих стыков выявил шесть различных сайтов стыковки. В пяти из них была найдена частичная гомология с сайтом связывания белка A и терминальной парой оснований Mu. Оставшийся сайт не имел гомологии с сайтом связывания.