Шпаргалка по "Геномике"

 

10.Секвенирование  с пом. нанопор. Исследовательская группа Амита Меллера сообщает о революционной работе по детектированию молекул ДНК, проходящих через нанопоры в кремнии. Для продавливания длинных нитей ДНК через поры (ширина кот сост-ет ≈ 4 нм) исследователи используют электрическое поле. Измерения позволяют фиксировать прохождение ч/з нанопору единичной молекулы НК. Рез-ты исследования демонстрируют возможность определения и анализа меньших количеств ДНК, чем это было возможно до наст времени. Секвенирование или профилирование генома с пом. нанопор позволит уменьшить количества ДНК, необходимых для анализа. В группе Меллера было решено использовать электрические поля, локализованные около «исходящих отверстий» нанопор для воздействия на длинные «-» заряженные нити ДНК и протаскивания их ч/з нанопоры, после прохождения которых молекула ДНК м. б. изучена подробнее. Такой подход позволяет использовать меньше кол-во копий ДНК для дальнейшего анализа. В процессе исследования неожиданно было обнаружено, что нити ДНК с большей длиной проходят ч/з поры с большей скоростью. Это обстоятельство позволяет говорить о том, что система из нанопор м. б. оптимизирована для детектирования длиных нитей ДНК, сост-х из десятков тысяч и даже большего кол-ва пар азотистых оснований. Это обстоятельство может привести к существенному ускорению процедуры анализа генома, позволяя непосредственно анализировать длинные цепи ДНК, вместо того чтобы нарезать их и восстанавливать их стр-ру по фрагментам коротких отрезков. Существующие технологии амплификации ДНК ограничивают размеры анализируемой ДНК тысячей пар оснований. Поск-ку новый метод позволяет избавиться от процедуры амплификации, он не только ↓ стоимость, временные затраты и уровень ошибок, характерные для анализа ДНК прежними методами, но и позволяет изучать нити ДНК, гораздо более длинные, чем возможно вследствие ограничений, характерных для сущ-х методов. Для изменения параметров электрич. поля около пор они применили градиенты концентрации солей, кот. позволили ускорить время захвата молекул ДНК полем, т.о, способствуя более быстрому их прохождению ч/з нанопоры и уменьшению кол-ва ДНК, необходимых для точных измерений.

 

12. Анализ ПДРФ геномной ДНК с пом.блоттинга по Саузерну. Блоттингом (буквально - промакивание) называют перенос фрагментов макромолекул (ДНК, РНК или белка), разделенных с помощью электрофореза в геле, на твердую подложку - мембрану. В исследованиях генома человека часто используют метод блоттинга, разработанный Сау-зерном, при котором олигонуклеотидный зонд, находящийся в растворе, гибридизуется с ДНК, адсорбированной на мембране. Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну мил-лионную часть генома. Саузерн-блот гибридизация - метод анализа структуры заданной области  генома, основанный на: - 1) расщеплении геномной  ДНК с помощью  эндонуклеаз рестрикции ;

- 2) разделении множества полученных фрагментов с по-мощью  электрофореза в плоской пластине агарозного или другого геля;

- 3) перенесении продуктов разделения на лист пористого материала, например, на нитроцеллюлозный фильтр таким образом, что все фрагменты ДНК переносятся на фильтр и закрепляются на нем, создавая отпечаток, идентичный рас-пределению фрагментов в геле после разделения;

- 4) гибридизации фильтра  с меченым радиоактивно или  с помощью красителя фрагментом  ДНК или РНК (пробой), который по  последовательности соответствует  анализируе-мому участку генома. В результате, проба за счет компле-ментарных взаимодействий связывается с теми участками фильтра, где находятся исследуемые фрагменты генома, и положение этих фрагментов идентифицируется по положе-нию метки из пробы на фильтре.

 

 

13 Использ. ПДРФ-анализа. ПДРФ – анализ митохондри-альной ДНК и кластера генов, кодирующих рибосомные РНК (рДНК), широко исп-ся в популяц. генетике, биогеографич. и филогенетич. иссл-х. Высокий консерватизм ПДРФ-маркеров позволяет использовать их при сравнительном картировании родственных видов. Напр, появление детальных ген. карт многих растений позволило сравнить м/у  собой ряд геномов, благодаря использованию общего набора ПДРФ-зондов. Впервые ПДРФ был использован как ген. маркер в 1974 г. при идентификации термочувствительной мутации в геноме аденовируса. Но широкое примен. вариантов полиморфизма ДНК в кач-ве ген. маркеров началось с 1980 г. после выхода работы Ботштейна с соавт., в кот. были изучены св-ва ПДРФ как ген. маркера, дано теоретическое обоснование его использования и предложен метод оценки уровня информативности. Самими авторами метод был с успехом применен для картирования генома чел. ПДРФ исп. для анализа полиморфизма конкретных локусов (генов). Способ анализа ПДРФ сводится к обработке ДНК рестриктазами с последующим электрофоретическим разделением полученной смеси и определением длин рестрикционных фрагментов после блот-гибридизации со специфическим меченым зондом. Основной причиной, приводящей к воз-никновению полиморфизма ДНК, первоначально считались точковые мутации (а также микроделеции и инсерции), за-трагивающие сайты узнавания тех или иных эндонуклеаз рестрикции. В послед. работах спектр возможных причин был расширен, осн. роль отводится таким факторам, как крупные делеции и вставки, трансверсии, транслокации, транспозиции мобильных ген. элементов  и т.п. Кроме того, нек-рые рестриктазы не способны расщеплять ДНК, если сайт узнавания содержит 1 или неск-ко метилированных ци-тозиновых остатков. С использованием ПДРФ-маркеров бы-ли получены первые успешные рез-ты по построению моле-кулярно-ген. карт многих видов раст. и жив, накоплены об-ширные сведения о ген. полиморфизме разл. орг-мов, выяв-лены ассоциации с хозяйственно-полезными признаками. Важным достоинством данного типа маркеров является вы-сокая воспроизводимость рез-тов, а также кодоминантный тип наследования.

 

 

14.ПЦР - диагностический прием, позволяющий определять специфические (вирусные) НК или их фрагменты с высокой степенью разрешения, разработан и впервые применен К. Миллис с соавторами в 1985-87 гг. В основе метода лежит многоцикловой процесс, напомин. естественную репликацию НК, каждый цикл состоит из 3 последовательных этапов. Разновидности: Вложенная ПЦР - применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Исполь-зуют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. Количественная ПЦР в реальном времени - в этом методе используют флу-оресцентно меченые реагенты для точного измерения кол-ва продукта р-ции по мере его накопления.Touchdown ПЦР - с пом. этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при t выше оптим. t отжига, затем каждые неск-ко циклов t снижают. При определенной t система пройдет ч/з полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК. Инвертированная ПЦР исп-ся в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной посл-ти. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить со-седние посл-ти после вставки ДНК в геном. Для осуществ-ления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В рез-те известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно. ПЦР с обратной тран-скрипцией  исп-ся для амплификации, выделения или иден-тификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с пом. ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, кот. исп-ся в кач-ве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены. Асимметричная ПЦР проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в нек-рых методиках секвенирова-ния и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за искл. того, что один из праймеров берется в большом избытке. Количественная ПЦР  используется для быстрого измерения кол-ва определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе. Метод молекулярных колоний - акриламид-ный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на по-верхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализи-руемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний. ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК. ПЦР длинных фрагментов модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК . Ис-пользуют смесь двух полимераз, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью, а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью. Вторая по-лимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой. RAPD ПЦР-этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК иссле-дуемых организмов. Подбирая условия,удается добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух орга-низмов. ПЦР с использованием горячего старта и нижней смесей с целью недопущения раннего смешивания компо-нентов реакции. До  начала реакции амплификатор необхо-димо прогреть до температуры плавления парафина. При-менение ПЦР. Исп-ся во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах. 1. Криминалистика 2. Установление отцовства 3. Медицинская диагностика 4. Персонализированная медицина 5. Клонирование генов 6. Секвенирование ДНК 7. Мутагенез. Приборная база для ПЦР. 1.амплификатор(или, как его еще называют, термоци-клера); 2.система для гель-электрофореза с источником пи-тания (для визуализации рез-тов ПЦР); 3. система гель-документации (для анализа результатов ПЦР); 4.ПЦР-бокс (для пробоподготовки); 5. вортекс; 6. микроцентрифуга; 7. набор автоматических дозаторов (механических или элек-тронных).

 

 

15. Основные методики  физического, генетического и цитологического  картирования. В отличие от генетических карт, построенных на основе групп сцепления и дающих статистические расстояния м/у  ДНК-маркерами и генами, физическое картирование позволяет определять физические расстояния м/у  маркерами в каждой хромосоме.  К методам физического картирования относят рестрикционное картирование, RH-картирование, клонирование в YAC (от англ. yeast artificial chromosome), BAC (от англ. bacterial artificial chromosome), космидах, плазмидах и других векто-рах и контиг-картирование на их основе, а также секвениро-вание ДНК. Использование искусственных хромосом создает основу для проведения физического картирования как на хромосомном, так и на субхромосомном уровне. Основой физического картирования генома является построение фи-зических карт, т.е. определение порядка расположения фи-зических маркеров вдоль молекулы ДНК. В качестве физи-ческих маркеров могут выступать сами гены, анонимные фрагменты ДНК (D-сегменты), точки расщепления ДНК ре-стриктазами и т. п. Было предложено стандартизовать все обозначения меченных последовательностей ДНК в геноме, включая все типы картированных последовательностей, будь то просто картированный сегмент ДНК с неизвестной функцией (D-сегменты), последовательность с необычными сайтами рестрикции, проба, выявляющая полиморфизм, по-следовательность, гибридизующаяся с определенным "бэн-дом" при гибридизации in situ или STS-маркеры (от англ. "sequenсed tagged site"). Основной особенностью STS-маркеров, а также и основным требованием к ним, является их уникальность в геноме. Эти маркеры облегчают перевод различной информации по картированию на единый "язык" STS для анализа и хранения генетической и молекулярной информации, кроме того, оптимизируется процесс насыщения физической карты генома человека маркерами. В настоящее время большое внимание уделяется переводу всех STS-маркеров на основу ПЦР для более удобного использования. Цитогенетическое картирование осуществляется с применением методов цитогенетики, когда для локализации каких-либо нуклеотидных последовательностей и определе-ния их взаимного расположения используются цитологиче-ские препараты.

16. Контиг-карты  хромосом чел... Контиговая карта или контиг (от contigous - протяженный) - включает в себя набор перекрывающихся клонированных фрагментов геномной ДНК в комплексе с информацией о порядке их перекрывания. Локализовать клонированный фрагмент можно, применяя методы гибридизации с пробами ДНК, локализация кот. известна, ПЦР-анализ, секвенирование. В наст. вр. создание контигов явл. общепринятым подходом к построению физич. карты генома чел. Рез-том картирования по этому методу явл. не только информация об относительном расположении маркеров и расстоянии м/у  ними, но и непосредственная доступность каждого картированного фрагмента ДНК для послед. структурных исследований, вплоть до расшифровки нуклеотидных посл-тей фрагментов ДНК и выявления их функцион. роли. В 1987 г. был описан метод получения т.н. искусственных дрожжевых хромосом (YAC), кот. способны включать в себя крупные фрагменты чужеродной ДНК, напр. ДНК чел, и репродуцировать эти фрагменты в процессе размножения дрожжевых кл. Фрагменты, кот. можно было бы таким образом клонировать, составляли 0,2 - 0,3 млн.п.н., и при размере генома чел. примерно в 3,5 млрд.п.н. около 10000 YAC-клонов могли "перекрыть" весь геном чел, что резко упростило бы задачу картирования этих фрагментов. Основу YAC представляет челночный плазмидный вектор на основе плазмиды pBR322, имеющий в своем составе все элементы дрожжевой хромосомы: центромеру (CEN4), две теломерные посл-ти (TEL), автономнореплицирующуюся  посл-ть (ARS1) и маркерные дрожжевые гены URA3 и TRP1, уч-щие в биосинтезе урацила и триптофана. Тем не менее техника клонирования в YAC-клонах имеет ряд слабых сторон. Это касается подверженности YAC-клонов физич. нестабильности (перестройкам, делециям) и химеризму. Известно, что до 50% клонов боль-ва мега-YAC-клонотек явл-ся химерными, т.е. они содержат ДНК из двух и более несмежных областей генома. Контиговая карта, сост. только из YAC-клонов, не обеспечивает доступности клонированных фрагментов ДНК, пригодных для тонкого структурного анализа и секвенирования. Вследствие этого, для более детального картирования специфических объектов, таких как CpG островки, гены, области хромосомных перестроек, горячие точки рекомбинации, а также для секвенирования генома необходимы контиги, построенные из относительно небольших перекрывающихся клонов, напр, космид. Эти требования м. б. выполнены при пом. объединения двух контиговых карт - YAC и космидной - путем гибридизации YAC-зондов с космидами представительных хромосом специфич. библиотек, что позволяет создать физич. карту в виде групп космид, расположенных в известном порядке. Осн. достоинством исп-ния контигов YAC-клонов как основы для построения космидных контигов явл. необходимость картирования лишь огранич. числа космид в пределах каждого YAC-клона, уже привязанного к определенному расположению на карте.  Порядок и ориентация отдельных космидных контигов (как друг относительно друга, так и всех вместе вдоль хромосомы) определяется последовательной гибридизацией с неск-кими YAC-клонами, по-разному их перекрывающими. Потенциальная разрешающая способность такой карты определяется кол-вом интервалов м/у  концами YAC-клонов, приходящимися на исследуемый уч-к хромосомы. Поэтому в последнее время в построение первичного YAC-контига вовлекаются библиотеки YAC-клонов с относительно малыми и средними размерами вставки - мини- и миди-YAC-клоны; таким путем увеличивается кол-во интервалов перекрывания. Для того, чтобы проверить соответствие построенного YAC-контига истинному расположению уч-ков генома применяется "Bottom Up"-подход, когда используется гибридизация in situ, или, чаще, полимеразная цепная реакция для сверки с посл-тью известных физич. маркеров на хромосоме. При ло-кализации к.-л. маркера, скрининг YAC-клонотеки прово-дится в 2 этапа. Позже, для устранения недостатков, связан-ных с клонированием в YAC, были созданы менее емкие, но более надежные векторы с использованием прокариотиче-ских хозяев: BAC, PAC, NAC и др, позволяющие клониро-вать фрагменты генома разной длины. Существенное пре-имущество ВАС-клонирования по сравнению с YAC-клонированием - структурная стабильность вставок, а также повышенная в 10 - 100 раз частота трансформации, что поз-воляет экономить геномную ДНК. Так, в последнее время при построении контигов генома человека используют BAC-клоны.

 

 

 

 

17. Картирование  методом дробовика (ShotGun) и кар-тирование с использованием случайных STS. Предполагает секвенирование коротких случайных фрагментов генома человека и подбор ПЦР-праймеров к этим фрагментам, т.е. создание STS. Используя радиационные гибриды клеток или иные системы, в том числе соматические гибриды и семьи полиморфных маркеров CEPH, можно определить по-ложение STS на физической и генетической карте генома человека. Недостатком данного подхода является невоз-можность оценить истинное расстояние м/у  STS-маркерами, что сильно снижает разрешающую способность получаемых карт. Важно отметить, что определить расстояние м/у  двумя STS крайне сложно - никто не может однозначно сказать, десятки или миллионы пар нуклеотидов разделяют два маркера. Это приводит к необходимости создания избыточного количества STS для относительно плотного покрытия участка генома. Опираясь на карту STS, клоны, содержащие векторы с крупными вставками (YAC, BAC, PAC, космиды), анализируют с помощью ПЦР и определяют минимальное количество перекрывающихся клонов, доста-точное для покрытия исследуемого участка генома. Затем секвенируют ДНК клонов, несущих крупные вставки, мето-дом ShotGun, т.е. получают клонотеки, содержащие не-большие (до 2 т.п.н.) случайные субфрагменты исходных крупных вставок, и секвенируют их концевые участки.

 Не так давно был  разработан новый вариант данного под-хода - стратегия секвенирования целых геномов методом ShotGun (the whole genome sequencing strategy, WGS). В этом методе используется частичное секвенирование как крупных вставок BAC- и PAC-клонов, так и клонов с относительно небольшими вставками (от 2 до 10 т.п.н.). BAC- и PAC-клоны, перекрывающие весь геном, должны быть тщательно картированы. Небольшие фрагменты ДНК для клонирования получают путем случайной физической фрагментации суммарной геномной ДНК.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

18. Рестрикционное  картирование генома чел. с исполь-зованием рестриктазы NotI. Рестрикционная карта - вид физич. карты, на кот. указаны расстояния м/у  соседними сайтами расщепления ДНК определенной рестриктазой, а также указан порядок следования сайтов рестрикции для одной или нескольких рестриктаз. При анализе крупных ге-номов или отдельных хромосом строят макрорестрикцион-ные карты, на которых указан порядок следования сайтов рестрикции крупнощепящих рестриктаз. Одним из крупно-масштабных подходов к картированию генома человека яв-ляется картирование с использованием NotI-прыжковых и связующих клонотек. Большим преимуществом картирова-ния с пом. NotI прыжковых и связующих клонотек явл. не-большой размер вставки в векторе клонирования и возмож-ность полной автоматизации всех этих этапов картирования. Основным принципом "прыжков" по хромосоме явл. клони-рование только концов крупных фрагментов ДНК, а не целых сегментов. ДНК, расположенная м/у двумя концами, делетируется с пом. различных методов, после чего прово-дится биохим. или генетич. отбор клонов, кот. содержат только искомые концевые фрагменты. Прыжковые клоны содержат фрагменты ДНК, кот. прилегают к соседним сайтам узнавания рестриктазой NotI, а связующие - фрагменты, расположенные около одного и того же сайта узнавания данной рестриктазой. Прыжковая клонотека NotI представ-ляет собой набор клонированных концевых фрагментов больших уч-ков генома, полученных при обработке суммар-ной хромосомной ДНК рестриктазой NotI. Связующая кло-нотека NotI содержит набор фрагментов ДНК, фланкирую-щих сайты узнавания NotI. Анализ связующей клонотеки в сочетанием с гель-электрофорезом в пульсирующем поле (PFGE) в принципе позволяет построить физич. карту хро-мосомы. Когда вставки клонов из связующей клонотеки ис-пользуют в кач-ве зондов при PFGE-блотинге генома, каж-дый зонд должен выявить 2 соседствующих в геноме фраг-мента ДНК. Теоретически одной клонотеки и одной обра-ботки рестриктазой достаточно, чтобы установить порядок расположения сайтов узнавания редкощепящих эндонуклеаз на физической карте хромосомы, однако практически это невозможно, т.к. многие рестрикционные фрагменты имеют одинаковую длину. Для разрешения возникающих неопре-деленностей необходимо использовать связующие клоноте-ки, созданные при пом. других редкощепящих рестриктаз, и с их пом. строить физич. карты исследуемых хромосом, как в случае обыкновенного рестриктазного картирования. "Прыжки" по хромосоме могут быть осуществлены с помо-щью клонотек со вставками крупного и среднего размера без использования связующих клонотек. Однако применение связующих клонотек в дополнение к прыжковым упрощает задачу. При последовательном скрининге двух клонотек можно "прыгать" от одного клона к другому (прыжковый клон - связующий клон - прыжковый клон и т.д.) и получать упорядоченные карты генома без использования геномного PFGE-блотинга. Совместное применение этих двух типов клонотек позволяет быстро продвигаться по хромосоме человека, так как геном человека содержит ограниченное число сайтов, узнаваемых рестриктазой NotI, - менее 10000. Т.о, ДНК NotI-прыжковых и NotI-связующих клонов, пере-крывающих весь геном человека, может быть упорядочена на одном фильтре с высокой плотностью. В этом случае скрининг клонотек может быть выполнен очень быстро. Од-нако использование гибридизационного подхода для уста-новления порядка расположения связующих и прыжковых клонов имеет некоторые ограничения из-за высокой степени фоновой гибридизации м/у  различными NotI-клонами. Дру-гим способом определения порядка клонов является секве-нирование прыжковых и связующих клонов NotI. Картиро-вание целых геномов методом случайного секвенирования было предложено для NotI-связующих и прыжковых клоно-тек в векторах lSK15 и lSK22 с использованием интегриро-ванного подхода. Эта стратегия основана на следующих по-ложениях: клонотеки конструируют в одних и тех же векто-рах и по одной схеме, т.е. два типа клонотек содержат фраг-менты ДНК одинаковой физической структуры, но упорядо-ченные по-разному; сайты NotI в этих клонотеках доступны для секвенирования со стандартными праймерами, т.е. ин-формацию о последовательности 800 - 1000 т.п.н., окружа-ющих NotI-сайт, можно легко получить путем автоматиче-ского секвенирования. Выделение плазмидной ДНК, как и секвенирование тысяч клонов, может быть автоматизировано. Линейный порядок NotI-клонов на хромосоме можно установить с помощью компьютерного анализа.