Шпаргалка по "Геномике"

1. История развития геномных исследований. Геномика – наука об исследовании геномов организма, включ-ая полное чтение всех последовательностей ДНК и их нанесение на генетические карты; рассматривает взаимодействие м/у ге-нами. История развития: 1975- Сенгер предложил метод терминации цепи. Для синтеза ДНК необходима ДНК-зависимая ДНК-полимераза, способная достраивать одноце-поч молек ДНК до двуцепочечной. Синтез в одном направ-лении от 5’ к 3‘концу. 1984-1986 – Кери Муллис изобрел ПЦР, позволяющий амплифицировать ДНК в ходе многократ последовательных удвоений молек ДНК с помощью ДНК-зы. Метод Сенгера был улучшен в лаборатории Лероя Худа, где в 1985г радиоактивную метку заменили люминисцентной. 1998г - появляется геном крупного червя C. Elegans. 2000 – первый растительный геном. Для чтения генома человека использовали «искусственные бактериал. хромосомы», геном разрезался на части по 150тыс нуклеотидов. Большая часть генома человека – некодирующая последовательность, лишь небольшая часть содержит гены. 2000 – опубликован геном дрозофилы. 2005г- опубликован геном шимпанзе (отлич от человеческого 2%). 2005г – предложен др. метод секвенирования при помощи праймеров, на которых ражмнож молекула ДНК. 2005 – illumine – третий метод чтения генома. 2008 – компания Хеликос разработала се-квинатор нового поколения. 2009 – революц новый способ чтения генома при пом ДНК-зы (Тертер). Вклад Крейга Вентера. 1995 – первый  полностью секвенированный геном свободноживущего организма бактерии Haemophilus influenzae, состоящего из 1 830 137 пн. В 1992 году Вентер основал Институт геномных исследований. 21 мая 2010 года Вентер заявил о создании им искусствен.клетки, содер-щей минимальн.набор генов.

 

 

 

 

 

2. Методы изучения  геномов. Современные подходы к  секвенированию ДНК. Секвенирование - метод расшифр нуклеотидной послед-ти НК в молекуле ДНК. Ф. Сенгер, в 70-х гг. изобрел первый метод прямого фермент секвенирования. Сущ-ет 2 осн метода секвенирования: м-д Максама - Гилберта (хим. расщепление ДНК по одному основанию) и м-д Сенгера (дидезокси м-д, более надежен прост и чаще используется на практике). В Оксфордской лаб-рии разработан м-д, позволяющ распозновать индивид азотистые основания в нити ДНК. В основе - разрушение нитей ДНК на индивид нуклеотиды, которые проходят ч/з белок-нанопору, закрепленную на двойном липид. слое. Во время связывания основания с порой понижается сила тока и для каждого из 4-х азот оснований наблюдается свойственный только ему уровень уменьшения этого показателя. Так их и различают. Секвенатор с пористым детектором позволяет считывать ДНК основание за основанием (без приготовл образца, обработки и хранения данных). Команда из Бостонского универа – новый м-д секвенирования на кремниевом чипе (более быстрое и дешевое). А.Меллер показал что с пом электромагнитных полей можно сделать быструю сортировку фрагм ДНК. Приложив напряжение м/у кремнием и проводником ч/з нанопору перемещ-ся отрезки ДНК( кол-во отрезков для детектора – НЕБОЛЬШОЕ). Традиционно для секвенирования нужно предварительно изготовить млн-ы копий молекулы ДНК. В текущем исследовании их нужно гораздо меньше. С помощью секвенатора можно уменьшить кол-во ДНК-фрагментов до 10000-100000.

 

 

 

 

 

3. Секвенирование  с пом. метода Сэнгера Метод секвени-рования НК путем "обрыва цепи" основан на синтезе новой ДНК-цепи на анализируемой ДНК-матрице с уч. ДНК - по-лимеразы в присутствии праймера и смеси дезоксинуклео-тидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) и на случайном обрыве синтезируемой цепи при встраивании 1 из меченных разными флуоресцентными красителями дидезоксинуклео-тидов (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP). Поск-ку "обрыв цепи" происходит статистически, то получается весь набор ДНК-фрагментов, отлич-ся м/у собой по длине всего на 1 нуклеотид. Затем полученная смесь ДНК-фрагментов обра-батывается формамидом для расхождения цепей и подверга-ется капиллярному электрофорезу в полиакриламидном геле, в рез-те чего фрагменты распределяются по длине. Ска-нирование лазером, возбуждающим флуоресценцию краси-телей, которыми были помечены дидезоксинуклеотидфос-фаты, позволяет определить последовательность нуклеоти-дов исходной мол. ДНК. В кл. ДНК-полимераза I уч. в про-цессе репликации, заполняя пробелы м/у вновь синтезиро-ванными фрагментами ДНК (фрагм. Оказаки). Для работы фермента в пробирке требуются dNTP, а также 1цепочечная матрица, на кот. д. б. небольшой 2хцепочечный уч-к - за-травка, с кот. начин. синтез. Синтезированы модифициро-ванные ddNTP, в кот. дезоксирибоза 3’-ОН отсутствует, для каждого из 4 оснований ДНК. ДНК-полимераза включает эти предшественники в ДНК. Но, включившись в ДНК, мо-дифицированное основание не м. образовать фосфодиэфир-ную связь со след. дезоксирибонуклеотидом. В рез-те рост (элонгация) данной цепи останавливается (терминируется) в том месте, где в ДНК включился ddNTP. Поэтому их назы-вают терминаторами элонгации.

 

 

 

 

 

 

4. Секвенирование  ДНК по Максаму-Гилберту.  В основе метода секвенирования ДНК путем химич. деградации лежит ограниченное расщепление меченого фрагмента ДНК под действием специфич. реагентов. Непременным усл. проведения секвенирования явл. наличие фрагмента ДНК, меченного только по одному концу. Разделение продуктов деградации по размеру с пом. высоковольтного электрофо-реза в полиакриламидном геле высокого разрешения, спо-собного разделять фрагменты ДНК, различ-ся м/у  собой по длине всего на 1 нуклеотид в достаточно широком диапазоне, и последующая радиоавтография геля позволяет определить нуклеотидную последовательность секвенированного уч-ка ДНК. 1ым этапом при проведении р-ции химич. деградации явл. ограниченная модификация определенных нуклеотидов под действием разл. хим. агентов. Концентр. агента и продолжит. его воздействия на мол. ДНК подбирается с таким расчетом, чтобы в каждой мол. произошла мо-дификация только 1 нуклеотида, а т.к. в реакционной смеси присутствует огромное кол-во таких молекул, то все осно-вания данного типа в секвенируемом фрагменте ДНК ока-жутся модифицированными. След. этапы удаления модифи-цированных оснований и β-элиминации обоих фосфатов, окружающих дезоксирибозу, и разрыва цепи должны прохо-дить уже количественно. Для каждого типа нуклеотидов или их комбинации проводят отдельные р-ции ограниченной модификации и количествен. расщепления. Т. о. в рез-те 4-ех (или иногда 3х, 5 или даже 6) типов р-ций обр-ся смесь олигонуклеотидных молекул, различ-ся по размеру на 1 нуклеотид и несущих на одном из концов метку, обычно ра-диоактивную. Кроме меченых молекул в реакционной смеси будут представлены, и олигонуклеотидные фрагменты, не несущие метки, но на этапе радиоавтографии они окажутся невидимыми и поэтому для данного метода они как бы не существуют. После разделения продуктов р-ции в соседних дорожках секвенирующего денатурирующего полиакрила-мидного геля и этапа радиоавтографии на рентгеновской пленке будет видна лестница из полос ДНК на соседних до-рожках, "чтение" кот. позволяет восстановить последова-тельность нуклеотидов секвенируемого фрагмента ДНК.

 

 

 

 

 

 

 

 

5. Автоматическое  секвенирование – электрофаретическое разделение меченых продуктов терми¬нирующих реакций с пом. специальных приборов - автоматических секвенаторов ДНК.  В основе автоматического секвенирования лежит метод ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP. Как и классический вариант Сэнгера, автоматическое секвенирование включает две стадии: проведение терминирующих реакций и разделение продуктов этих реакций с помощью электрофореза. Как правило, автоматизирована лишь вторая стадия, т.е. разде-ление меченных фрагментов ДНК в ПААГ, получение спек-тра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных. Т. о., автоматическое секвенирование отличается от ручного секвенирования только типом используемой метки. Флуоресцентную метку включают либо в праймер, либо в терминатор транскрипции согласно схемам: меченный праймер (четыре разных красителя) и немеченые тер-минаторы; меченный праймер (один краситель) и немеченые терминаторы; меченные терминаторы (каждый тип терми-натора своим красителем) и немеченый праймер. Использо-вание меченных праймеров предполагает проведение четырех независимых реакций (отдельно с каждым из терминаторов) для каждого секвенируемого образца. Использование меченных терминаторов позволяет совместить все четыре реакции в одной пробирке. Если используется единственный краситель, то разделение продуктов сиквенсовой реакции в геле проводят на четырех разных дорожках. Использование четырех разных красок позволяет разгонять продукты реак-ции(й) на одной дорожке.

Современные секвенаторы можно разделить по типу прово-димого электрофореза на капиллярные и те, в кот. разделение происходит в гелевых пластинах. Наиб. успешным се-квенатором начала 90-х стал ABI 373 (Applied Biosystems). В этой модели используется одновременная детекция 4 краси-телей, возбуждаемых излучением аргонового лазера. Лазер генерирует непрерывное излучение в сине-зеленой обл. спектра (488-514 нм). Разделение фрагментов проводится в геле толщиной 0.4 мм. Первичные данные представляют со-бой наборы из 4 чисел для каждой точки сканирования (по ширине геля), собранные ч/з равные интервалы времени в теч. всего электрофореза. Среди секвенаторов, детектирующих флуоресценцию одного красителя, можно выделить се-квенатор MicroGene Blaster фирмы Visible Genetics. Позво-ляет одновременно проводить анализ 4х образцов, меченных Cy5.5, на 16-ти дорожках. Разделение происходит в однора-зовых MicroCel кассетах, заполняемых фотополимеризуемым акриламидом. Высота кассет позволяет секвенировать от 300  до 700 нуклеотидов. Секвенаторы, работающие на двух красителях в инфракрасной области спектра - IR2 DNA Sequencer, секвенатор ABI Prism 377.  Однокапиллярный се-квенатор ABI Prism 310, способный в автоматическом режиме последовательно просканировать 96 образцов, способен прочитать ≈ 450 нуклеотидов. Секренаторы восьмика-пиллярные Beckman CEQ 2000 (Beckman Coulter), шестна-дцатикапиллярный ABI Prism 3100 или 96-ти капиллярных ABI Prism 3700 и MegaBACE 1000 (Amersham-Pharmacia-Biotech-Molecular Dynamics).

 

 

 

 

 

 

6. Пиросеквенирование. Метод пиросеквенирования ДНК (П. Ниреном) основан на многошаговой детекции неоргани-ческого пирофосфата, образующегося из дНТФ (или ддНТФ) в процессе присоединения ДНК-полимеразой соответствующего нуклеотидмонофосфата к 3'-концу растущей цепи ДНК, иммобилизованной на твердом носителе. Образующийся в процессе присоединения очередного нуклеотида неорганический пирофосфат под действием АТФ-сульфурилазы преобразует аденозинфосфо-сульфат в молекулу АТФ, которая, в свою очередь, необхо-дима для осуществления ферментативной реакции окисления люциферина люциферазой с выделением квантов света.

 

 

 

 

 

 

7. Бисульфитное  секвенирование — это примене-ние бисульфатной обработки к ДНК для определения пат-терна метилирования. Бисульфитное секвенирование осно-вано на том факте, что обработка ДНК бисульфитом пре-вращает остатки цитозина в урацил, но не затрагивает остатки 5-метилцитозина. Дальнейш анализ сводится к раз-личению однонуклеотидных полиморфизмов и к разделению в сиквенсах Ц и Т(цитозинов и тиминов). Другие м-ды вместо обработки бисульфитом для различения метилирования аллелей предполагают специфич по метилированию рестрикцию и иммунопреципитацию метилированной ДНК.

Методы анализа метилирования ДНК, иные, чем ПЦР, спе-цифичный к метилированию. После бисульфитной конвер-сии геномная ДНК амплифицируется при помощи ПЦР, ко-торая не различает метилированные и неметилированные последовательности. Для разделения ампликонов после би-сульфитной конверсии в таком случае применяют различные методы.

 

 

 

 

11. Современные  подходы к картированию геномов. ПДРФ-анализ. Генетич. картирование - это картирование, основанное на определении групп сцепления, частоты ре-комбинации и построении ген. карт, где единицей измерения служат % рекомбинации, или сантиморганы (сМ). Цито-генетич. картирование осущ-ся с применением методов ци-тогенетики, когда для локализации к-л. нуклеотидных посл-тей и определения их взаимного расположения используются цитологические препараты. Физич. картирование  - это обширная группа методов, позволяющая строить карты ге-нома высокого уровня разрешения и определять расстояния м/у локализуемыми нуклеотидными посл-тями с точностью от неск-ких десятков тысяч п.н. до 1 нуклеотидной пары. Выделяют 3 основных подхода к картированию геномов: функциональный, кандидатный и позиционный. 1)Вплоть до последнего времени в картировании доминировал  функци-ональный подход. Методически такое картирование начина-ется с выделения в чистом виде белкового продукта гена. Далее к нему по аминокислотной посл-ти подбирают вы-рожденные праймеры и проводят ПЦР-скрининг геномных библиотек. Однако список генов, для кот. эта информация была достаточно полной к настоящему времени практически исчерпан и боль-во генов, ф-ция кот. была известна, уже клонированы и локализованы. 2)Близко к функциональному и кандидатное картирование. В этом случае информация о функциональном изменении недостаточно полна, чтобы точно указать ген, но достаточна для того, чтобы выдвинуть более или менее обоснованные предположения о возможных кандидатах либо по их ф-ции, либо по положению на хромосоме. И при функциональном, и при кандидатном подходе клонирование гена, как правило, предшествует его точной локализации в геноме, т.е. картированию. 3) Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так называемый ПДРФ-анализ включает след. этапы: выде-ление геномной ДНК, ее рестрикцию специфической эндо-нуклеазой, электрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рестрик-ции, путем блот-гибридизации по Саунзеру.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8-9. Мультиплексное секвенирование ДНК, основанное на одновременном использовании целого набора плазмидных векторов plex00-20, было разработано первоначально  для метода секвенирования ДНК путем химич. деградации с целью повышения его производительности. Главный прин-цип секвенирования ДНК с пом. мультиплексного подхода заключается в одновременном проведении терминирующих реакций со всеми секвенируемыми матрицами ДНК, клони-рованными изначально в различных специализированных векторах. Затем следует их разделение в секвенирующем полиакриламидном геле, перенос на мембранный фильтр и фиксация перенесенных фрагментов ДНК на этом фильтре. Т.о, на фильтре оказываются фиксированными "невидимые" лестницы полос всех исследуемых фрагментов ДНК. Для их выявления необходимы этапы молекулярной гибридизации с мечеными олигонуклеотидными зондами, гомологичными каждый раз фрагменту только одного определенного вектора из пула использованных. Так, 20 самостоятельных плаз-мидных векторов plex00-20 несут по 2 различающихся уч-ка для отжига праймеров каждый, что составляет 40 вариантов "тэгов". Аналогичными "тэгами" располагают и одиннадцать М13р1ех и пять Plex векторов. В результате гибридизации с каким-либо меченым олигонуклеотидным праймером после радиоавтографии на рентгеновской пленке становились видны полосы ДНК, принадлежащие только одной конкретной матрице. Для выявления следующего клона не-обходим этап полного удаления первого меченого зонда и повторная гибридизация с новым зондом. И так столько раз, ск-ко матриц в различающихся векторах было первоначально взято в исследование. Необходимым усл. осуществления мультиплексного секвенирования ДНК явл-ся перенос фрагментов ДНК из полиакриламидного секвенирующего геля на мембранный фильтр, т.к. проведение всех этих по-следовательных процедур гибридизации, окрашивания, от-мывки возможно только с мембранным фильтром. Второе условие заключается в прочной сорбции фрагментов ДНК на данном фильтре, выдерживающей многократные инкубации в различных р-рах. В противном случае мультиплексное секвенирование будет просто невозможно. Немаловажное значение имеет тип используемой метки. Обычно мульти-плексное секвенирование проводится с немеченными фраг-ментами ДНК и уже потом выявление на фильтре секвени-руемых полос ДНК зависит от специфической пробы, ме-ченной тем или иным соединением (радиоактивностью, био-тином и др.), что делает неизбежным этап блот-гибридизации. Однако было предложено интересное решение по мультиплексному секвенированию нескольких матриц ДНК, не требующее этапа гибридизации со специфическими пробами. Суть этого способа заключ. в одновременном разделении в одном геле по-разному меченных фрагментов ДНК, принадлежащих конкретным матрицам, и поэтому этот метод назвали мультиплексным мечением. в кач-ве праймеров были использованы олигонуклеотиды, меченные по 5*-концу разными гаптенами: биотином, дигоксигенином, 2,4-динитрофенилом и флуоресцеином. В рез-те терминирующих реакций, секвенирующего электрофореза, переноса фрагментов ДНК из геля на мембранный фильтр, проводимых одновременно со всеми этими матрицами, по-явилась возможность сразу, без этапа гибридизации, после-довательно выявлять на фильтре полосы ДНК, соотв. опре-деленным матрицам, что в значит. мере способствовало более быстрому получению данных. Одно из главных отличий этого подхода от обычного мультиплексного секвенирования заключ. в том, что здесь электрофоретическому разделению подвергаются продукты терминирующих реакций, уже несущие определенные, различные для каждой матрицы метки. Для выявления меченных ими фрагментов ДНК, пе-ренесенных на мембранный фильтр, необходимо проведение соответств. последовательных процедур. Для подобного се-квенирования не требуется клонирования или переклониро-вания вставки в специализированном векторе, поэтому в ка-честве зондов (в данном случае - секвенирующих праймеров) могут выступать стандартные универсальные праймеры, меченные по 5'-концу различными гаптенами. Т. о, становятся необходимы только этапы связывания конъюгата антител к соответств. гаптену и щелочной фосфатазы и затем с пом. хемилюминесценции 1,2-диоксетанового субстрата выявления полос ДНК на фильтре. Наибольшую чув-ствительность имеет система с биотинилированным прай-мером.