Природные флавоноиды. Методы исследования. Официнальные растительные источники терапевтически активных флавоноидов

Очень лабильны и поэтому в растениях не накапливаются в больших количествах.

Природные дигидрофлавононы, соответствующие флавонолам кемпферолу и кверцетину, называются аромадендрин и таксифолин:

Аромадендрин Таксифолин

(дигидрокемпферол) (дигидрокверцетин)

Большинство дигидрофлавонолов выделено из древесины хвойных (сосна - Pinus silvestris, ель - Picea abies, лиственница - Larix sibirica) и лиственных (эвкалипт - Eucalyptus globules, вишня - Cerasus vulgaris) пород.

Особую группу флавоноидов составляют соединения с пятичленным гетероциклическим кольцом, так называемые ауроны, это производные 2 - бензилиден кумаранона или 2 - бензфуранона:

Аурон

Считается, что ауроны могут образовываться из соответствующих халконов под действием, обнаруженного в растениях фермента - халконазы.

Они встречаются в растениях редко, например, в семействах астровых (Asteraceae), бобовых (Fabaceae), норичниковых (Scrophulariaceae).

В растениях присутствуют в форме гликозидов. Это желтые, оранжевые или оранжево - красные пигменты растений.

3. Физико-химические свойства флавоноидов

В чистом виде флавоноиды - кристаллические соединения, бесцветные (изофлавоны, катехины, лейкоантоцианидины, флаванонолы, флаваноны), желтые(флавоны, флавонолы, халконы, ауроны), а также окрашенные в красный, синий или фиолетовый цвета (антоцианидины). Без запаха, горького вкуса, с определенной температурой плавления (гликозиды 100 - 180°С, агликоны до 300°С). [2]

В зависимости от рН среды: в кислой среде они имеют оттенки красного или розового цветов; в щелочной - синего.

Гликозиды, катехины и лейкоантоцианидины хорошо растворимы в воде, этаноле и метаноле различной концентрации, но нерастворимы в полярных органических растворителях.

Агликоны, за исключением катехинов и лейкоантоцианидинов растворяются в этиловом эфире, ацетоне, этилацетате, спиртах, практически не растворимы в воде. Агликоны и гликозиды флавоноидов лишены запаха. Некоторые из них обладают горьким вкусом. Флавоноидные гликозиды обладают оптической активностью, способны к кислотному и ферментативному гидролизу. Скорость гидролиза и условия его проведения различны для различных групп флавоноидов.

О - гликозиды при действии разбавленных минеральных кислот и ферментов гидролизуются до агликона и углеводного остатка.

С - гликозиды с трудом расщепляются лишь при действии крепких кислот (конц. хлористоводородная или уксусная - смесь Килиани) при длительном нагревании.

Катехины и лейкоантоцианидины легко окисляются в присутствии кислорода воздуха, под действием света и щелочей, превращаясь в окрашенные соединения - продукты конденсации, вплоть до высокомолекулярных полимерных форм. При нагревании до температуры 200°С эти соединения возгоняются, а при более высокой температуре разрушаются.

4. Методы выделения и идентификации флавоноидов

Для выделения флавоноидов проводят экстракцию растительного материала этанолом или метанолом, учитывая растворимость агликонов и гликозидов флавоноидов в спирте.

Спиртовое извлечение упаривают, к остатку добавляют горячую воду и после охлаждения удаляют неполярные соединения (хлорофилл, жирные и эфирные масла), т.к. при охлаждении они выпадают в осадок, который отделяют.

Часто для отделения сопутствующих веществ сырье сначала обрабатывают хлороформом, т.е. «обезжиривают», а затем уже экстрагируют спиртом разной концентрации.

Спиртовое извлечение исследуют.

Проводят качественный и количественный анализ.

Флавоноиды из водной фазы извлекают последовательно этиловым эфиром (агликоны), этилацетатом (в основном монозиды) и бутанолом (биозиды, триозиды).

Для разделения компонентов каждой фракции используют колоночную хроматографию на силикагеле, полиамидном сорбенте или целлюлозе, что показывает таблица. [6]

Элюирование веществ проводят смесью хлороформа с метиловым спиртом с возрастающей концентрацией метилового спирта, спирто - водными смесями с возрастающей концентрацией спирта, если сорбентом служит полиамид, или 5 - 30% - ной уксусной кислотой в случае целлюлозы.

Для выделения отдельных флавоноидов существуют специфические методы.

Так, для выделения рутина из бутонов софоры японской (Fructus Sophorae japonicae) экстракцию проводят горячей водой. При охлаждении водных извлечений рутина выпадает в осадок, его отфильтровывают и очищают перекристаллизацией из спирта.

Софора японская (Sophorae japonicae)

Семейство бобовые (Fabaceae)

Описание:

Крупное дерево высотой до 20 м с округлой широкой кроной. Листья очередные, непарноперистые, до 25 см длиной, с короткими черешками, состоят из 5 - 7 пар продолговато - эллиптических листочков. Цветки бело - желтые, неправильные, типичного мотылькового строения, собраны в многоцветковые метелки. Плоды - четковидноперетянутые бобы длиной 3 - 7 см с мясистыми стенками и 2 - 8 семенами. Незрелые бобы зеленые, зрелые красноватые. Цветет в июне - июле. Плоды созревают в августе - сентябре и держатся на дереве всю зиму. От других деревьев семейства бобовых софора отличается четковидными невздутыми бобами и отсутствием колючек.

Распространение:

В диком виде встречается и в Китае и в Японии. Широко культивируется в городских насаждениях, парках, скверах, придорожных посадках. Растение теплолюбиво, поэтому разводится в южных областях России. [5]

Заготовка:

В медицинских целях используют бутоны и плоды дерева. Бутоны софоры японской собирают в сухую погоду после обсыхания росы в конце бутонизации этого растения (в июне - июле), когда часть бутонов у основания соцветия начинает распускаться. При этом осторожно отламывают соцветия с еще недозревшими светло - зелеными мясистыми и сочными плодами, семена которых лишь начинают темнеть. Перед сушкой от плодов отделяют и отбрасывают веточки соцветий. Как только веточки соцветий станут хрупкими, сушку прекращают.

Химический состав:

Наиболее ценное биологически активное вещество софоры японской - рутин, представляющий собой глюкорамногликозид кверцетина. Его наличие установлено в бутонах, цветках, листьях, молодых ветках и молодых плодах. Особенно много рутина накапливается в молодых, быстро развивающихся органах растения. Максимальное количество его отмечено в бутонах. В плодах в период их созревания содержится 8 флавоноидов, количество которых меняется в зависимости от места и времени сбора. Помимо рутина, обнаружены кемпферод-3-софорозид, кверцетин-3-рутинозид и генистеин-2-софорабиозид. В цветках обнаружены алкалоиды и гликозиды. В листьях найдены рутин (софорин) и до 47 мг% витамина С. Семена содержат до 10% жирного масла.

Применение:

Препараты софоры обладают ранозаживляющими свойствами, ускоряют регенерацию тканей, уменьшают проницаемость и хрупкость капилляров, повышают способность организма усваивать аскорбиновую кислоту. Плоды оказывают бактерицидный эффект по отношению к золотистому стафилококку и кишечной палочке.

Настойку софоры назначают внутрь для лечения и профилактики кровоизлияний, употребляют внутрь при повышенном давлении крови, язве желудка и двенадцатиперстной кишки, дизентерии. Наружно применяют в виде примочек, орошений при острых и хронических гнойных воспалительных процессах (абсцессы, флегмоны, раны, трещины сосков грудных желез, ожоги, трофические язвы).

Для идентификации флавоноидов используют их физико-химические свойства:

· Определение температуры плавления

· Определение удельного вращения гликозидов

· Сравнение УФ, ИК, масс -, ПМР спектров со спектрами известных образцов.

УФ спектр флавоноидов характеризуется наличием, как правило, двух максимумов поглощения. УФ спектроскопия успешно используется для установления свободных ОН - групп в молекуле флавоноида путем добавления различных реактивов (ацетата натрия, метилата натрия, борной кислоты с ацетатом натрия, хлористого алюминия). [11]

При добавлении этих реактивов происходит смещение максимумов поглощения, характерное для гидроксильных групп в различных положениях.

В ИХ спектре флавоноидов имеются полосы поглощения, характерные для различных группировок.

5. Методы исследования флавоноидов

1. Качественное определение

Для обнаружения флавоноидов в ЛРС используют химические реакции и хроматографию. Химические реакции подразделяются на цветные и реакции осаждения.

1.1. Цветные реакции

1.1.1. Цианидовая  проба

Характерной реакцией на флавоноиды является - цианидовая проба или проба Синода (проба Chinoda) (основана на восстановление их атомарным водородом в кислой среде в присутствии магния или цинка). [6]

Флавоноиды при восстановлении магнием или цинком в присутствии концентрированной хлористоводородной кислоты образуют красное окрашивание, обусловливаемое образованием антоцианидинов:

Хроменол

Цианидин хлорид

Реакция очень чувствительна, основана на восстановлении карбонильной группы и образовании антоцианида. Халконы и ауроны при помощи цианидиновой реакции не обнаруживаются, но при добавлении конц. HCL (без магния) образуют красное окрашивание за счет образования оксониевых солей.

1.1.2. Борно - лимонная  реакция (реакция Вильсона - Таубека)

5 - оксифлавоны и 5 - оксифлавонолы  взаимодействуют с борной кислотой  в присутствии лимонной (или щавелевой), образуя ярко - желтое окрашивание с желто - зеленой флуоресценцией (образование батохромного комплекса):

1.1.3. Реакция с  треххлористой сурьмой

5 - оксифлавоны и 5 - оксифлавонолы, взаимодействуя с треххлористой  сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или красный цвет:

1.1.4. Реакция с раствором аммиака и щелочи

С раствором аммиака, щелочи флавоны, флаваноны, флавонолы, флаванонолы дают желтое окрашивание, при нагревании переходящее в оранжевое или красное;

Халконы и ауроны тотчас же дают красное или пурпурное окрашивание.

Чистые катехины окрашивания не дают, однако присутствие даже в небольшом количестве примесей (продуктов окисления) вызывает появление желтой окраски.

Антоцианы в присутствии аммиака или карбоната натрия дают синее или фиолетовое окрашивание.

1.1.5. Реакция с 1 -%-м раствором ванилина в конц. HCL

Образуют красно - малиновое окрашивание катехины (производные флороглюцина и резорцина).

1.1.6. Реакция с 1 -%-м спиртовым раствором AlCl3

О наличии флавоноидов говорит желто - зеленое окрашивание.

1.2. Реакции осаждения

Все флавоноиды с основным ацетатом свинца образуют осадки, окрашенные в ярко - желтый или красный цвет.

Средним ацетатом свинца осаждаются лишь флавоноид, содержащий свободные ортогидроксильные группы в 3'4' - положениях кольца В. [6]

1.3. Хроматография

С целью обнаружения флавоноидов в растительном материале широко используется хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента.

Обнаружение компонентов на хроматограмме осуществляется просматриванием их в УФ свете.

При этом флавоны, флавонол - 3 - гликозиды, флаваноны, халконы и их 7 - гликозиды - в виде желтых или желто - зеленых пятен; флавонолы и их 7 - гликозиды - в виде желтых или желто - зеленых пятен; ксантоны в виде оранжевых пятен.

Изофлавоны при этом не проявляются.

После просматривания в УФ свете хроматограммы можно обработать одним из реактивов:

1) 5-%-ным спиртовым раствором AlCl3 с последующим нагреванием  при 105°С в течение 3-5 минут; (ярко - желтая окраска пятна в видном свете и яркую желто - зеленую флуоресценцию в УФ - свете);

2) с 5-%-ной SbCl3 в четыреххлористом  углероде (реактив Мартини - Беттоло); желтая или желто - оранжевая окраска  указывает на наличие флавонов, флавонолов, флаванонов и изофлавонов; красная или красно - фиолетовая - халконов.

3) с 2-%-ным спиртовым раствором  щелочи

4) при обработке пятна  парами аммиака усиливается голубая  флуоресценция (изофлавоноиды) что  позволяет получить зоны с  более яркой флуоресценцией в  УФ свете.

Реактив Вильсона (раствор борной и б/в лимонной кислоты в б/в метаноле)

5) реакция азосочетания - на наличие 7 - оксифлаванолов,

7-оксиизофлаванолов. [11]

2. Количественное определение

В последние годы все большее распространение получают различные физико - химические методы анализа, которые имеют ряд существенных преимуществ в сравнении, например, с гравиметрическими и титрометрическими методами, а именно, быстрота и точность определения, обнаружение даже незначительных количеств и, что особенно важно, возможность выделения отдельных флавоноидов из растительного сырья.

К таким методам относятся фотоэлектроколориметрия, спектрофотометрия, денситометрия с использованием хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента.

Сущность хроматоденситометрического метода заключается в выделении и разделении флавоноидов с непосредственной количественной денситометрической оценкой окрашенной зоны на хроматограмме.

Метод имеет преимущества в быстроте проведения анализа и точности определения, так как в данном случае исключается стадия элюирования.

Используется фотоколориметрический метод, основанный на измерении оптической плотности окрашенных растворов, полученных в цветных реакциях флавоноидов с солями различных металлов (алюминия, циркония, титана, хрома, сурьмы), с лимонно - борным реактивом и на реакции восстановления цинком или магнием в кислой среде.

Известна цветная реакция флавоноидов с азотнокислым и уксуснокислым уранилом, позволяющая количественно определять рутин в смеси с кверцетином. [6]

В настоящее время широко используется метод спектрофотометрический.

6. Заготовка сырья, сушка, хранение

Заготовка

Проводится в фазу наибольшего накопления флавоноидов:

· Бутонизации: бутоны софоры японской (Alabastra Sophorae japonicae), траву череды (Herbae Bidens tripartita);

· Начала цветения: цветки бессмертника песчаного (Flores Helichrysum arenarium), пижмы (Flores Tanacetum vulgare), трава пустырника (Herbae Leonurus cardiaca);

· Массового цветения: цветки василька синего (Flores Centaurea cyanus), траву зверобоя (Herbae Hypericum perforatum), горцев перечного, почечуйного и птичьего (Polygonum hydropiper; Polygonum persicaria; Polygonum aviculare), фиалки (Viola tricoior), сушеницы топяной (Gnaphalium uliginosum);

· Вегетации: траву хвоща полевого (Herbae Equisetum arvense), листья чая китайского (Folium camellia sinensis);

· Плодоношения: плоды боярышника (Fructus Crataegus sanguinea), рябины черноплодной (Fructus Aronia melanocarpa), софоры японской (Fructus Sophorae japonicae);

· Осенью корни стальника (Radix Ononis spinosa) и шлемника байкальского (Radix Scutellaria baicalensis);