Хроматографические методы анализа ЛРС,содержащего сердечные гликозиды

Большое значение, особенно для эффективности разделения, имеют такие характеристики сорбентов, как диаметр частиц, среднее распределение  частиц по размерам и размер пор. В  классической тонкослойной хроматографии  для производства пластинок используются частицы с размером 5 - 20 мкм. Для  высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) необходим сорбент, диаметр  частиц которого составляет 5 - 7 мкм. Сравнение  характеристик пластинок для ТСХ и ВЭТСХ приведено в табл. 2. Монолитные сорбенты представляют собой новое поколение стационарных фаз, которые могут быть использованы и в планарной хроматографии получают прямой сополимеризацией метакриловых полимеров, например, сополимера глицинметакрилата и этилендиметакрилата. Монолитные стационарные фазы не содержат частиц, а роль разделительного пространства выполняют поверхность и объем проточных каналов (пор). Макропористая структура монолитных сорбентов содержит как минимум два вида пор: макро- и мезопоры. Преимущества таких носителей заключаются в заметном повышении скорости и эффективности разделения, так как для них отсутствуют обычные диффузионные ограничения межфазного массообмена.

Таблица 2. Сравнение характеристик пластинок для классической (ТСХ) и высокоэффективной (ВЭТСХ) тонкослойной хроматографии.

Характеристики	ТСХ	ВЭТСХ
Средний размер частиц, мкм	5 -20	5-7
Толщина слоя, мкм	250	100,200
Количество проб	12	36-72
Длина пробега фронта растворителя, мм	100 – 150	30-50
Время разделения, мин	30 – 200	3-20
Количество растворителя, мл	50	5-10
Флуоресценция	1-100	0,1-10

 

Основные  типы сорбентов, используемых в ТСХ

Силикагель- полярный адсорбент, содержит активные силанольные и силоксановые группы, его применяют для разделения соединений различной полярности.

Оксид алюминия- полярный адсорбент с гетерогенной поверхностью, содержит активные ОН-группы, обладает заметно выраженными протоноакцепторными свойствами; его применяют для разделения ароматических углеводородов, алкалоидов, хлоруглеводородов, стероидов

Флоросил - основной силикат магния, занимает промежуточное положение между оксидом алюминия и силикагелем; удобен для разделения флаваноидов, стероидов и ацетилированных углеводородов

Полиамиды - группа полярных сорбентов со смешанным механизмом разделения: карбоксамидная группа ответственна за адсорбционный механизм, метиленовые звенья - за распределительный механизм. Эти сорбенты применяют для разделения пищевых красителей, флаваноидов, танинов, нитрофенолов, спиртов, кислот.

Модифицированные  силикагели с привитыми группами (амино, циано, диол-, C2-,Cg-, C1g-), отличными по полярности[8].

Важной характеристикой  сорбента является его активность, она зависит от содержания воды и  понижается при увеличении содержания воды в сорбенте.  

Для успешного  разделения смесей веществ большое  значение имеет выбор сорбента. В  первую очередь нужно исходить из свойств разделяемых соединений: их растворимости (гидрофильности, гидрофобности), содержания и характера функциональных групп. Насыщенные углеводороды адсорбируются  слабо или совсем не адсорбируются  на силикагелях и оксиде алюминия. Введение двойных связей, особенно сопряженных, увеличивает адсорбционную  способность соединений.

Функциональные  группы в еще большей степени  усиливают способность веществ  к адсорбции. Адсорбционная способность  функциональных групп возрастает в  следующем порядке:

СН=СН<ОСНз<СООR <C=O<CHO<SH<NН2<OH<COOH[10].

3.3Количественная оценка содержания вещества в хроматографическux зонах

Для количественной оценки содержания вещества в хроматографическux зонах используют различные методы:

1. Определение с удалением хроматографической зоны с пластинки можно проводить двояким образом: переносом хроматографической зоны вместе с сорбентом либо экстрагированием хроматографической зоны со слоя сорбента.

2. Определение соединений непосредственно  на пластинке методом визуального  сравнения размеров площадей  пятен и их окраски с соответствующими  параметрами пятен стандартных  образцов

3. Метод денситометрии, повышающий  точность результатов определения,  основан на сканировании хроматограмм в видимом и УФсвете с помощью «хроматографических спектрофотометров» денситометров. Денситометры позволяют измерять поглощение света веществом на хроматограмме в режиме пропускания или отражения, а также флуоресценцию и ее тушение. Режим пропускания доступен, если только исследуемое вещество имеет полосу поглощения в видимой области спектра. В У Ф-области регистрацию в режиме про пускания осуществить нельзя из-за собственного поглощения силикагеля и подложки хроматограммы.

4. Денсuтометрuя с планшетным сканером с программным обеспечением для обработки хроматограмм практически не отличающимся от стандартных программ, применяемых для видеоденситометров, но существенно меньшей стоимости. При этом сканирование дает более четкое изображение хроматографических зон, что можно объяснить пониженным влиянием неравномерности освещения анализируемых объектов, чем в случае видеоденситометра.

5. Метод вuдеоденсuтометрuu - сравнительно новый метод для количественной обработки хроматограмм. Принцип метода заключается во введении изображения хроматограммы в компьютер с помощью видеокамеры или цифровой камеры с последующим сравнением интенсивностей пятен стандартных и определяемых соединений. Видеоденситометр включает осветительный блок, видеокамеру с платой видеоввода или сканер, персональный компьютер с установленной операционной системой Windows и соответствующим программным обеспечением. В России такие комплексы производят НТЦ «Ленхром» (г. С.-Петербург) - денситометр «ДенСкан-О4» и «Сорбполимер» (г. Краснодар) денситометр «Сорбфил». Программа обработки хроматографических данных позволяет выполнять следующие функции: вводить изображения хроматограмм и сохранять их с высоким качеством и разрешением; выделять на введенном изображении хроматограммы рабочий участок, на котором будет производиться дальнейшая обработка изображения; производить автоматический или ручной поиск пятен; проводить обработку пятен, переводить их в форму хроматографических пиков, рассчитывать значения Rr и площади пиков; измерять содержание вещества в анализируемых пятнах (в относительных единицах); вводить значения концентраций для построения градуировочных зависимостей: линейной интерполяцией; линейной аппроксимацией более чем, через две точки; квадратичной интерполяцией; автоматически вычислять содержание вещества в анализируемых пятнах по введенным калибровочным значениям; представлять результаты в виде печатных документов.

 

3.4Обнаружение сердечных гликозидов в ЛРС методом ТСХ

Горицвета весеннего трава

Adonidis vernalis herba

Тонкослойная  хроматография

Испытуемый  раствор. К 1,0 г измельченного сырья прибавляют 10 мл метанола Р и нагревают с обратным холодильником на водяной бане в течение 10 мин. Охлаждают и фильтруют.

Раствор сравнения. 1 мг кофейной кислоты Р, 2,5 мг гиперозида Р и 1 мг хлорогеновой кислоты Р растворяют в 10 мл метанола Р.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля Р.

Подвижная фаза: кислота муравьиная безводная Р — кислота уксусная ледяная Р — вода Р — этилацетат Р (7:7:14:72, об/об/об/об).

Наносимый объем пробы: по 20 мкл в виде полос.

Фронт подвижной фазы: не менее 10 см от линии старта.

Высушивание: при температуре от 100°С до105°С.

Проявление: пластинку опрыскивают раствором 10 г/л дифенилборной кислоты аминоэтилового эфира Р в метаноле Р и затем раствором 50 г/л макрогола 400 Р в метаноле Р.

Пластинку высушивают на воздухе в течение 30 мин и просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм.

Результаты: ниже приведена последовательность зон хроматограмм раствора сравнения и испытуемого раствора. На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживаются и другиефлуоресцирующие зоны[5].

Верх хроматографической пластинки
Кофейная кислота: флуоресцирующая зона светло-синего цвета ————             Гиперозид: флуо- ресцирующая зона желтовато- коричневого цвета       Хлорогеновая кисло- та: флуоресцирующая зона светло-синего цвета ————	Одна или две флуо- ресцирующие зоны синего цвета (кофей- ная кислота) ———— Одна или две флуо- ресцирующие зоны желтовато-зеленого цвета Флуоресцирующая зона желтого цвета         Флуоресцирующая зона желтовато- коричневого цвета флуоресцирующая зона светло-синего цвета (хлорогеновая кислота)                  ———— Флуоресцирующая зона желтовато- коричневого цвета
Раствор сравнения	Испытуемый раствор

 

 

 

 

Ланд ыша листья

Convallariae folia

Тонкослойная хроматография.

Испытуемый раствор. К 1,0 г измельченного сырья прибавляют 20 мл спирта (50 %,об/об) Р, 10 мл раствора 100 г/л свинца (II) ацетата Р и нагревают с обратным холодильником на водяной бане в течение 2 мин. Охлаждают,

центрифугируют. Надосадочную жидкость дважды встряхивают с хлороформом Р порциями по15 мл, затем дважды встряхивают со смесью из

хлороформа  Р и метанола Р (50:50, об/об) порциями по 15 мл. При необходимости слои разделяют центрифугированием. Хлороформные слои объединяют, фильтруют через бумажный фильтр с 2 г натрия сульфата безводного Р и выпаривают досуха. Остаток растворяют в 1 мл

смеси из хлороформа Р и метанола Р (50:50,об/об).

Раствор сравнения. 5 мг конвалатоксина Р растворяют в 1 мл смеси из хлороформа Р и метанола Р (50:50, об/об).

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля G Р.

Подвижная фаза: хлороформ Р — метанол Р — вода Р (80:18:2, об/об/об).

Наносимый объем пробы: по 10 мкл в виде полос.

Фронт подвижной фазы: не менее 12 см от линии старта.

Высушивание: на воздухе.

Проявление: пластинку опрыскивают реактивом ванилина Р и нагревают при температуре от 100°С до 105°С в течение 5 мин. Просматривают при дневном свете.

Результаты: на хроматограмме раствора сравнения обнаруживается зона зеленого цвета со значением Rf 0,38—0,48 (конвалатоксин).На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживается зона, соответствующая по расположению и цвету зоне конвалатоксина на хроматограмме раствора сравнения. На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживаются и другие

Зоны[5].

 

Наперстянки пурпурно й листья

Digitalis purpureae folia

Тонкослойная  хроматография

Испытуемый раствор. К 1,0 г измельченного сырья (180) прибавляют смесь из 20 мл спирта (50 %, об/об) Р и 10 мл раствора свинца (II)ацетата Р. Кипятят в течение 2 мин. Охлаждают и центрифугируют. Встряхивают надосадочную жидкость дважды с хлороформом Р, порциями по 15 мл; при необходимости слои разделяют центрифугированием. Хлороформные слои объединяют и высушивают с помощью натрия сульфата безводного Р и фильтруют. 10 мл полученного раствора выпаривают досуха на водяной бане, остаток растворяют в 1 мл смеси изравных объемов хлороформа Р и метанолаР.

Раствор сравнения. 5 мг ФСО пурпуреагликозида А, 2 мг ФСО пурпуреагликозида B, 5 мг дигитоксина Р и 2 мг гитоксина Р растворяют

в смеси из равных объемов хлороформа Р и ме- танола Р и доводят до 10 мл этой же смесью растворителей.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля G Р.

Подвижная фаза: вода Р — метанол Р —этилацетат Р (7,5:10:75, об/об/об).

Наносимый объем пробы: по 20 мкл в виде полос длиной 20 мм и шириной около 3 мм.

Фронт подвижной фазы: не менее 10 см от линии старта.

Высушивание: на воздухе.

Проявление: пластинку опрыскивают смесью из 2 объемов раствора 10 г/л хлорамина Р и 8 объемов раствора 250 г/л кислоты трихлоруксусной Р в 96 % спирте Р. Нагревают при температуре от 100°С до 105°C в течение 10 мин.

Просматривают в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм.

Результаты: на хроматограмме раствора сравнения в нижней части обнаруживается флуоресцирующая зона светло-синего цвета (пурпуреагликозид В) и несколько выше — флуоресцирующая зона коричневато-желтого цвета (пурпуреагликозид A). В средней части обнару-

живается флуоресцирующая зона светло-синего цвета (гитоксин) и над ней — флуоресцирующая зона коричневато-желтого цвета (дигитоксин).

На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживаются зоны, соответствующие по расположению, цвету и величине зонам на хромато-

грамме раствора сравнения. На хроматограмме испытуемого раствора могут обнаруживаться и другие флуоресцирующие зоны[5].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

 

Хроматография представляет собой метод разделения и определения веществ, который  основан на распределении компонентов  между двумя фазами – подвижной  и неподвижной. При этом неподвижной (стационарной) фазой служит твердое  пористое вещество (часто его называют сорбентом) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза представляет собой жидкость или  газ, протекающий через неподвижную  фазу, иногда под давлением.

Сам процесс  хроматографии проводится в специальном  приборе, который называется хроматографом. Функцию разделения смеси веществ на индивидуальные компоненты выполняет колонка, которая содержит хроматографический сорбент. В качестве подвижной фазы используется элюент - газ, жидкость или (реже) сверхкритический флюид. Для регистрации концентрации компонентов смеси на выходе из колонки используется специальный детектор. Результат зависимости концентрации компонентов на выходе из колонки от времени регистрируется на хроматограмме.

Одним из эффективных методов хроматографии  является метод жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), - метод разделения и анализа  сложных смесей веществ, в котором  подвижной фазой является жидкость. Метод ВЭЖХ применим для разделения значительно более широкого круга  веществ, чем газовая хроматография, поскольку большая часть веществ  не обладает летучестью, а многие вещества неустойчивы при высоких температурах.

Тонкослойная  хроматография занимает одно из ведущих  мест в качественном и полуколичественном анализе сложных природных, фармацевтических, медикобиологических и химических объектов.

Высокоэффективная жидкостная и тонкослойная хроматографии нашли своё широкое применение в фармакогнозии – науке, изучающей лекарственные средства, получаемые из лекарственного растительного и животного сырья, а также продуктов их жизнедеятельности и некоторые продукты их первичной переработки (эфирные и жирные масла, смолы, млечные соки и др.). Метод ВЭЖХ и ТСХ позволяет определить количественный и качественный состав лекарственных средств растительного и природного происхождения, разделяя их на составные элементы (анализируя), а также выделять полезные с точки зрения медицины вещества, содержащиеся в природном или животном сырье.