Хроматографические методы анализа ЛРС,содержащего сердечные гликозиды

В ВЭЖХ разделение обычно происходит при комнатной  температуре. ВЭЖХ подразделяется на варианты в соответствии с характером основных проявляющихся межмолекулярных  взаимодействий:

1) в ситовой хроматографии разделение  компонентов осуществляется за  счет разницы в растворимости  молекул при их прохождении  (фильтрации) через слой сорбента;

2) в адсорбционной хроматографии  – за счет разницы в адсорбируемости молекул, проходящих через слой частиц сорбента, покрытых неподвижной фазой в виде тонкого слоя или поверхностнопривитых радикальных групп;

3) в ионообменной и ионной  хроматографии – за счет разницы  в способности к обмену ионами с ионообменниками[2].

Для анализа  объектов окружающей среды наиболее широко используют ВЭЖХ в адсорбционном  и ионообменном вариантах.

В зависимости  от природы подвижной и неподвижной  фазы различают нормально-фазовую (НФХ) и обращенно-фазовую (ОФХ) хроматографию. В нормально-фазовой ВЭЖХ неподвижная фаза является полярной (чаще всего силикагель), а подвижная – неполярной (гексан, либо смеси гексана с более полярными органическими растворителями – хлороформом, спиртами и т.д.).

Удерживание веществ растет с увеличением  их полярности. Разделения компонентов  достигают, меняя элюрующую силу подвижной фазы, которая зависит от энергии взаимодействия компонентов подвижной фазы с поверхностью неподвижной фазы. В нормально-фазовой хроматографии элюирующая способность подвижной фазы увеличивается с ростом ее полярности.

В обращенно-фазовой хроматографии неподвижная фаза - неполярная (гидрофобные силикагели с привитыми группами С₈, С₁₈), а подвижная фаза – полярная (смеси воды и полярных растворителей: ацетонитрила, метанола, тетрагидрофурана и др.). Удерживание веществ растет с увеличением их гидрофобности (неполярности). Наименьшей элюирующей способностью обладает вода, а для повышения элюирующей способности в подвижную фазу вводят ацетонитрил, метанол и другие растворители. Чем больше содержание органического растворителя, тем выше элюирующая способность подвижной фазы.

Подвижная фаза, прежде всего, должна растворять разделяемые  компоненты. Основными характеристиками подвижных фаз являются ее элюирующая способность и селективность. Элюирующая способность подвижной фазы – это ее способность вступать в межмолекулярные взаимодействия с разделяемыми соединениями и группами на поверхности сорбента. Эти взаимодействия способствуют десорбции разделяемых соединений, более быстрому перемещению хроматографических зон[4].

Обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) имеет ряд преимуществ перед другими вариантами жидкостной хроматографии. В обращенно-фазовой хроматографии неподвижной фазой служат гирдофобизированные силикагели, которые получают при обработке силикагеля хлор- и алкоксисиланом.

 

1.3 Преимущества использования ВЭЖХ в изучении природных соединений

Высокоэффективная жидкостная хроматография нашла  своё широкое применение в фармакогнозии  – науке, изучающей лекарственные  средства, получаемые из лекарственного растительного и животного сырья, а также продуктов их жизнедеятельности  и некоторые продукты их первичной  переработки (эфирные и жирные масла, смолы, млечные соки и др.). Метод  ВЭЖХ позволяет определить количественный и качественный состав лекарственных  средств растительного и природного происхождения, разделяя их на составные  элементы (анализируя), а также выделять полезные с точки зрения медицины вещества, содержащиеся в природном  или животном сырье.

В связи с  введением в практику фармацевтического производства Беларуси стандарта GMP, значимость использования современных унифицированных методов анализа повысилась, как на предприятиях-производителях, так и в системе государственного контроля качества лекарственных средств. Базовым методом анализа качества субстанций и готовых лекарственных средств в странах с развитой фармацевтической промышленностью (США, Англия. Япония, страны ЕС) является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Данный метод по своим характеристикам соответствует требованиям количественного анализа около 80-90% препаратов[3].

Произошедшие  за последние годы изменения в фармацевтической отрасли Беларуси, направленные на модернизацию производств, способствовали внедрению ВЭЖХ в контроль качества технологического процесса. Организации-разработчики также начали более активно включать ВЭЖХ метод в соответствующие разделы фармакопейных статей и технологических регламентов. Стали появляться хроматографы в региональных органах контроля качества лекарственных средств. Вместе с тем, при общей положительной направленности, процесс в значительной мере сдерживается отсутствием общей упорядоченности.

Главным преимуществом  предложенного подхода к фармакопейному анализу по сравнению с традиционным, является существенное сокращение времени анализа при одновременном снижении затрат на проведение анализа в десятки раз. Так, например, анализ субстанции ампициллина по требованиям Европейской фармакопеи занимает 17-18 часов и для его проведения необходимо приготовить 9 вспомогательных растворов. Этот же анализ на отечественной хроматограмме «Милихром А-02» (методом ВЭЖХ) занимает всего 30 мин и не требует использования каких-либо вспомогательных калибровочных растворов[3].

2. Изучение растений методом ВЭЖХ

2.1 Разделение сердечных гликозидов методом ВЭЖХ

Сердечные гликозиды  найдены во многих семействах растений. Они используются для лечения  болезней, вызванных ослаблением  сердечной деятельности.

Сердечные гликозиды  содержат два типа агликонов – с пятью- или шестичленным лактоновым циклом. Гликозиды с агликонами первого типа называют карденолидами (например, дигитоксигенин), а гликозиды с агликонами второго типа получили название буфанолиды или буфадиенолиды (сцилларенин).

Предложенные  методики разделения сердечных гликозидов предусматривают использование  ионно-обменной, адсорбционной и обращённо-фазовой хроматографии. В некоторых случаях перед разделением исходные гликозиды переводят в их производные.

Сердечные гликозиды, содержащиеся в растениях рода Digitalis, можно разделить на силикагеле или на обращённой фазе. Проведённое сравнительное изучение этих двух подходов показало, что адсорбционная и обращено-фазовая хроматография дополняют друг друга. Поскольку элюирование в этих двух системах действительно происходит в обратном порядке, каждый может, как правило, выбрать такую систему, которая больше отвечает требованиям (например, по времени разделения или разрешению). Если разделение ведётся на силикагеле, в качестве элюента рекомендуется пользоваться смесью дихлорметан/метанол/вода (920:80:12), тогда как идеальными элюентами для разделения на колонках с химически привитой обращённой фазой С₁₈ являются смеси ацетонитрил/вода (37:63) и диоксан/вода (45:55). Обнаружение осуществляется ультрафиолетовым детектором (230 нм).

Обращённо-фазовые системы несколько более предпочтительны с точки зрения подготовки для анализа проб готовых форм.

Буфадиенолидные гликозиды, содержащиеся в растениях рода Urginea maritina, различных родов Scilla, были проанализированы качественно и количественно методом обращено-фазовой ВЭЖХ при элюировании смесями ацетонитрил/вода. Наличие системы сопряжённых двойных связей в этих гликозидах облегчает их обнаружение по поглощению в ультрафиолетовой области при 280 или 300 нм.[9,12]

Некоторые типичные примеры разделения при помощи ВЭЖХ сердечных гликозидов приведены  в таблице 1.

Таблица 1 – Разделение сердечных гликозидов

Разделяемые гликозиды	Неподвижная фаза	Элюент	Обнаружение, нм
Гликозиды дигиталиса (низкой полярности)	Лихросорб Si-60	н-Пентанол/ ацетонитрил/ изооктан/H2O (175:60:620:10)	220
Гликозиды дигиталиса (средней и высокой  полярности)	Лихросорб Si-60	трет-Бутанол/ацетонитрил/ гептан/ H2O (204:93:712:10,4)	220
Ланатозид С и сопутствующие вещества	Лихросорб Si-100	Дихлорметан/метанол/ H2O (320:80:12)	230
Гликозиды дигиталиса	Нуклеосил С18	Ацетонитрил/H2O (37:63), диоксан/H2O (45:55), ТГФ/диоксан (2:1)/H2O/(67:33)	230
Буфадиенолидные гликозиды (гликозиды Scilla)	Нуклеосил С18 или μ-бондапак С18	Ацетонитрил/H2O (1:3)	280
	Лихросорб RP-8	Ацетонитрил/H2O (18:28)

 

 

Для анализа  бутадиенолидов и карденолидов особенно эффективна обращено-фазовая хроматография на μ-бондапаке при элюировании смесями метанол/вода (2:1), ацетонитрил/вода (1:1) или ТГФ/вода (2:3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.Тонкослойная хроматография

3.1 Достоинства и недостатки ТСХ

Тонкослойная  хроматография занимает одно из ведущих мест в качественном и полуколичественном анализе сложных природных, фармацевтических, медикобиологических и химических объектов. Среди других хроматографических методов тонкослойную хроматографию отличают следующие достоинства и особенности:

- это единственный хроматографический метод, позволяющий проводить полный анализ неизвестной смеси, поскольку исследователь имеет возможность проверить, не остались ли на старте неэлюированные компоненты;

-по производительности превосходит газовую и высокоэффективную жидкостную хроматографию, по крайней мере, на порядок; использует более простое и дешевое оборудование;

- обладает высокой селективностью, которую легко варьировать, подбирая  состав подвижной фазы; в отличие  от ВЭЖХ нет ограничений в  выборе растворителей;

- дает возможность одновременного  разделения нескольких образцов; использования однократного или  многократного элюирования (при  различных условиях), а также одновременного  разделения компонентов одного  и того же образца с помощью  различных элюентов;

- возможна оптимизация разрешающей способности хроматографической системы при разделении сложной смеси только для интересующих компонентов, что позволяет экономить время;

- возможно детектирование соединений с высокой чувствительностью и селективностью, которые легко варьировать подбором проявляющего реагента; -полученные результаты разделения легко оценить визуально;

-можно сохранять хроматограммы для последующегодетектирования и осуществлять спектральную идентификацию хроматографических зон после разделения в любом диапазоне длин волн, включая ИК.

У тонкослойной хроматографии есть и некоторые недостатки:

- ограниченная разделяющая способность  из-за сравнительно небольшой  длины разделяющей зоны (3-10 см);

- чувствительность ниже, чем в  случае ВЭЖХ;

- зависимость результатов анализа  от окружающей среды: относительной  влажности, температуры, а также  наличия загрязняющих веществ  в воздухе;

- трудности в работе с образцами,  имеющими высокую летучесть, а  также с веществами, чувствительными  к действию кислорода воздуха  или света.

Классическая, наиболее простая и широко используемая методика тонкослойной хроматографии  включает проведение следующих основных операций:

1)нанесение анализируемой пробы  на слой сорбента;

2)разделение компонентов пробы  на отдельные зоны в потоке  подвижной фазы;

3) обнаружение зон на слое  сорбента (часто реагентом, образующим  с разделенными веществами окрашенные  соединения);

4) количественная оценка полученного  разделения, включая определение  величины удерживания и определение  содержания вещества в зонах на хроматограмме[8].

Положение зоны вещества на хроматограмме характеризуется величиной Rf, которая равна отношению расстояния от стартовой линии до центра зоны вещества к расстоянию от стартовой линии до линии фронта. Значение Rf - величина постоянная для данного соединения в данной истеме и зависит от ряда условий: способа элюирования, качества и активности сорбента, толщины слоя, качества растворителей, количества нанесенного вещества, длины пробега растворителей, положения стартовой линии и почти не зависит от температуры. По этой величине проводят идентификацию компонентов в смеси[19].

На качество разделения компонентов смеси в  тонкослойной хроматографии влияет большое число факторов: тип разделительной камеры; предварительное насыщение камеры и слоя сорбента парами подвижной фазы; стартовый размер пятна; расстояние от старта до нижнего края пластинки; относительная влажность воздуха лабораторного помещения; средний диаметр частиц и их форма; толщина и равномерность нанесения слоя сорбента; наличие микроповреждений слоя; тип вещества, связывающего сорбент; скорость элюирования; объем растворителя в камере; наличие примесей в элюенте; конвекция в газовой фазе внутри камеры[4].

 

3.2Сорбенты в тонкослойной хроматографии

В качестве сорбентов в ТСХ применяют  материалы, которые отвечают следующим  требованиям: образуют химически и  физически стабильные слои; не образуют ковалентных связей с разделяемыми веществами; не растворяются в подвижной  фазе или перемещаются вместе с ней  по пластинке; не содержат компонентов, мешающих разделению или детектированию; не имеют собственной окраски; не набухают и не сжимаются под действием  подвижной фазы.

В качестве подложки для сорбента используется стекло, алюминиевая фольга, полимерные пленки (полиэтилентерефталат). Для  придания стабильности слоя сорбента на подложке используются различные связующие вещества: гипс (5-10%), силиказоль, силикаты щелочных металлов, полиакриламид, полиакриловый эфир, крахмал. К адсорбенту часто добавляют флуоресцентный индикатор для детектирования веществ, поглощающих в УФ-области спектра. С этой целью используют: смесь силикатов цинка и магния; смесь сульфидов цинка и кадмия; вольфраматы щелочноземельных элементов.