Хроматографические методы анализа ЛРС,содержащего сердечные гликозиды

 

 

МИНИСТЕРСТВО  ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УО «Витебский государственный медицинский университет»

 

Кафедра фармакогнозии с курсом ФПК и ПК

 

 

                                                    Курсовая работа

Тема: «Хроматографические методы анализа ЛРС,содержащего сердечные гликозиды»

 

 

 

                                                                 Выполнила:студентка 1 группы 3 курса

                                                 фармацевтического факультета

                                                            Гречишникова Екатерина Николоевна                                                     

                                      Научный руководитель:

                                      доцент Кузьмичёва Н. А.

                                       

 

Витебск, 2012

Содержание

Введение	3
1 Основы теории и основные понятия высокоэффективной жидкостной хроматографии	5
1.1 Хроматография как метод исследования объектов окружающей среды	5
1.2 Классификация видов хроматографии	7
1.3 Преимущества использования ВЭЖХ в изучении природных соединений	13
2 Изучение растений методом ВЭЖХ	15
2.1 Разделение сердечных гликозидов методом ВЭЖХ	15
3.Тонкослойная хроматография. 3.1 Достоинства и недостатки ТСХ	18 18
3.2Сорбенты в тонкослойной хроматографии	20
3.3Количественная оценка содержания вещества в хроматографическux зонах                                                                                                                          3.4Обнаружение сердечных гликозидов в ЛРС методом ТСХ	23 25
Заключение	28
Список использованной литературы	31

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Фармакогнозия - одна из фармацевтических наук, изучающая лекарственные средства, получаемые из лекарственного растительного и животного сырья, а также продуктов их жизнедеятельности и некоторые продукты их первичной переработки (эфирные и жирные масла, смолы, млечные соки и другие). Особое место в фармакогнозии отводится анализа лекарственного растительного и животного сырья, так как только раскладывая природные соединения на составные элементы, изучая состав, можно сделать вывод об их лечебных свойствах.

Лекарственные средства, полученные из природных  соединений, отличаются от лекарственных  средств, выработанных путём синтеза  тем, что их состав не всегда однозначен. Так, одни и те же растения могут  содержать разный состав, если они  выращены в разных природно-климатических  условиях, а что касается искусственно созданных лекарств, то их состав и  свойства задаются технологией их производства. Именно поэтому анализ лекарственных  средств, созданных из растительного  и животного сырья, фактически является неотъемлемой частью их разработки и  использования.Методами анализа в фармакогнозии являются метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и метод тонкослойной хроматографии(ТСХ). Более того, данные методы позволяют выделять полезные с точки зрения медицины вещества, содержащиеся в растительном и животном сырье и использовать их в производстве лекарственных средств. Всё это и обуславливает актуальность темы курсовой работы.

Цель курсового  исследования – изучение метода ВЭЖХ и ТСХ и их практического применения.

Задачи исследования:

1) Раскрыть сущность  и содержание хроматографии как  метода исследования объектов  окружающей среды.

2) Рассмотреть  вопросы классификации видов  хроматографии и определить место  и роль ВЭЖХ и ТСХ среди  них.

3) Дать основные  характеристики ВЭЖХ и ТСХ  и общее описание системе, используемой  для проведения разделения природных  веществ методом ВЭЖХ и ТСХ.

4) Рассмотреть  вопросы практического применения  метода ВЭЖХ и ТСХ в фармакогнозии.

При написании  курсовой работы использовались различные  источники, полный перечень которых  приведён в конце работы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 Основы теории и основные понятия  высокоэффективной жидкостной хроматографии

1.1 Хроматография как метод исследования  объектов окружающей среды

Хроматография в настоящее  время является наиболее широко используемым методом исследования объектов окружающей среды. Хроматографический метод был предложен в 1903 году русским ученым М.С. Цветом. Его работы послужили фундаментом для развития остальных видов хроматографии для разделения как окрашенных, так и неокрашенных соединений, осуществляемых в любых средах [1].

Хроматография – это метод  разделения и определения веществ, основанный на распределении компонентов между двумя фазами – подвижной и неподвижной. Неподвижной (стационарной) фазой служит твердое пористое вещество (часто его называют сорбентом) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза представляет собой жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу, иногда под давлением[13].

Компоненты анализируемой  смеси (сорбаты) вместе с подвижной фазой передвигаются вдоль стационарной фазы. Ее обычно помещают в стеклянную или металлическую трубку, называемую колонкой. В зависимости от силы взаимодействия с поверхностью сорбента (за счет адсорбции (поглощения) или по какому-либо другому механизму) компоненты будут перемещаться вдоль колонки с разной скоростью. Одни компоненты останутся в верхнем слое сорбента, другие, в меньшей степени взаимодействующие с сорбентом, окажутся в нижней части колонки, а некоторые и вовсе покинут колонку вместе с подвижной фазой (такие компоненты называются неудерживаемыми, а время их удерживания определяет «мертвое время» колонки). Таким образом, происходит быстрое разделение сложных смесей компонентов.

Сам процесс хроматографии  проводится в специальном приборе, который называется хроматографом. Функцию разделения смеси веществ  на индивидуальные компоненты выполняет колонка, которая содержит хроматографический сорбент. В качестве подвижной фазы используется элюент - газ, жидкость или (реже) сверхкритический флюид. Для регистрации концентрации компонентов смеси на выходе из колонки используется специальный детектор. Результат зависимости концентрации компонентов на выходе из колонки от времени регистрируется на хроматограмме. Типичная хроматограмма приведена на рисунке 1.

А

t

tR(1)

tR(2)

tm

W(1)

W(2)

Рисунок 1. – Типичная хромотограмма смеси двух веществ [18].

Рассмотрим основные хроматографические параметры (см. рис. 1.), характеризующие поведение вещества в колонке.

Время от момента ввода анализируемой пробы до момента регистрации максимума хроматографического пика называют временем удерживания и обозн ачают – tR. Время удерживания складывается из двух составляющих – времени пребывания веществ в подвижной фазе (tm) и времени пребывания в неподвижной фазе (ts). Сопоставление площадей или высот хроматографических пиков позволяет оценить количественный состав смеси.

 

1.2 Классификация видов хроматографии

Классификация видов хроматографии  осуществляется по различным критериям.

По агрегатному состоянию  фаз:

1) Газовая хроматография:

а) газо-жидкостная хроматография;

б) газо-твёрдофазная хроматография.

2) Жидкостная хроматография:

а) жидкостно-жидкостная хроматография;

б) жидкостно-твёрдофазная хроматография;

в) жидкостно-гелевая хроматография;

3) Сверхкритическая флюидная хроматография[17].

Газовая хроматография - метод разделения летучих компонентов, при котором подвижной фазой служит инертный газ (газ-носитель), протекающий через неподвижную фазу с большой поверхностью. В качестве подвижной фазы используют водород, гелий, азот, аргон, углекислый газ. Газ-носитель не реагирует с неподвижной фазой и разделяемыми веществами. Различают газо-твёрдофазную и газо-жидкостную хроматографию. В первом случае неподвижной фазой является твёрдый носитель (силикагель, уголь, оксид алюминия), во втором - жидкость, нанесённая на поверхность инертного носителя. Разделение основано на различиях в летучести и растворимости (или адсорбируемости) компонентов разделяемой смеси. Этот метод можно использовать для анализа газообразных, жидких и твёрдых веществ с молекулярной массой меньше 400, которые должны удовлетворять определённым требованиям, главные из которых - летучесть, термостабильность, инертность, лёгкость получения. Этим требованиям в полной мере удовлетворяют, как правило, органические вещества, поэтому газовую хроматографию широко используют как серийный метод анализа органических соединений.

Принцип жидкостной хроматографии  состоит в разделении компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна. В зависимости от того, какое вещество используется в качестве твёрдой фазы, различают жидкостно-жидкостную хроматографию, жидкостно-твёрдофазную хроматографию и жидкостно-гелевую хроматографию.

Особенностью сверхкритической флюидной хроматографии является то, что в качестве подвижной фазы используется сверхкритический флюид.

По механизму взаимодействия существует:

1) распределительная хроматография;

2) ионообменная хроматография;

3) адс орбционная хроматография;

4) эксклюзионная хроматография;

5) осадочная хроматография[20].

В распределительной ВЭЖХ разделение происходит за счет разной растворимости разделяемых веществ в неподвижной фазе, как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя, и в подвижной фазе - растворителе.

Ионообменная хроматография является более частным вариантом ионной хроматографии. Этот вариант хроматографии позволяет разделять ионы и полярные молекулы, на основании зарядов разделяемых молекул. Данный вид хроматографии позволяет разделить практически любые заряженные молекулы, в том числе: крупные - белки, малые - молекулы нуклеотидов и аминокислот. Часто ионообменная хроматография используют как первый этап очистки белков.

Адсорбционная хроматография - вид хроматографии основанный на способности твёрдого вещества - неподвижной фазы – сорбировать (поглощать) примеси, находящиеся в подвижной фазе. При этом эффективность разделения примесей пропорциональна их величинам адсорбции при условиях эксперимента. Процесс взаимодействия может сопровождаться химическим взаимодействием примесей с неподвижной фазой, то есть хемосорбцией.

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры носителя. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор носителя. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры сорбента.

Осадочная хроматография - метод хроматографии, основанный на способности разделяемых веществ образовывать малорастворимые соединения с различными произведениями растворимости. В качестве неподвижной фазы выступает инертный носитель, покрытый слоем осадителя. Разделяемые вещества, находящиеся в подвижной фазе, вступают во взаимодействие с осадителем и образуют малорастворимые вещества — осадки. При дальнейшем пропускании растворителя происходят поочерёдно: растворение этих осадков, перенос вещества по слою неподвижной фазы, снова осаждение и так далее. При этом скорость перемещения осадка по неподвижной фазе пропорциональна его произведению растворимости.

 

По цели проведения выделяется:

1) аналитическая хроматография;

2) препаративная хроматография;

3) промышленная хроматография[20].

Аналитическая хроматография  проводится в определённых аналитических  целях.

Препаративная хроматография - вид хроматографии, проводимый с целью выделения индивидуальных соединений из смеси в чистом виде в небольших количествах в лабораторных условиях. В отличие от аналитической хроматографии, препаративные разделения проводят на колонках большого диаметра и используют специальные устройства для сбора отдельных компонентов (фракций).

Промышленная хроматография  используется для получения чистых веществ в значительных количествах  в условиях производства (промышленные масштабы).

По способу ввода пробы  выделяют:

1) Элюентную хроматографию (проявительная, редко элюативная). Наиболее часто используемый вариант проведения аналитической хроматографии. Анализируемую смесь вводят в поток элюента в виде импульса. В колонке смесь разделяется на отдельные компоненты, между которыми находятся зоны подвижной фазы.

2) Фронтальную хроматографию. Смесь непрерывно подают в колонку, при этом на выходе из колонки только первый, наименее удерживаемый компонент можно выделить в чистом виде. Остальные зоны содержат 2 и более компонентов. Родственный метод - твердофазная экстракция (сорбционное концентрирование).

3) Вытеснительную хроматографию. В колонку после подачи разделяемой смеси вводят специальное вещество-вытеснитель, которое удерживается сильнее любого из компонентов смеси. Образуются примыкающие друг к другу зоны разделяемых веществ[20].

Приведенная выше классификация  хроматографических методов не является исчерпывающей, так как в последние годы появился ряд комплексных (гибридных) хроматографических методов.

Рассмотрим  более подробно виды ВЭЖХ.

Итак, жидкостная хроматография (ЖХ) - метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой  является жидкость. Подвижная фаза в жидкостной хроматографии выполняет  двоякую функцию:

1) обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке (подобно подвижной фазе в газовой хроматографии);

2) регулирует константы равновесия, а, следовательно, и удерживание  в результате взаимодействия  с неподвижной фазой (сорбируясь на поверхности) и с молекулами разделяемых веществ[18].

В жидкостной хроматографии природа подвижной  фазы имеет существенно большее  значение. В результате комбинации ограниченного числа сорбентов  и неограниченного числа, различных  по составу, подвижных фаз возможно решение чрезвычайно большого числа  встречающихся на практике задач. Метод  ВЭЖХ применим для разделения значительно  более широкого круга веществ, чем  газовая хроматография, поскольку  большая часть веществ не обладает летучестью, а многие вещества неустойчивы  при высоких температурах.