ТСХ в современном анализе лекарственных форм

Самый простой способ получения системы с любой элюирующей способностью состоит в смешивании двух растворителей с разной полярностью. Однако не всякая система, в которой значение Rf =0,5, обеспечивает хорошее разделение данной группы веществ. Поэтому иногда бывает необходимо испробовать несколько систем растворителей различной природы с приблизительно одинаковой элюирующей способностью и остановиться на той, в которой разделение компонентов смеси будет оптимальным.

Правильный подбор сорбента играет также не маловажную роль в полном разделении смеси веществ. При выборе сорбента отправным моментом является количество и характер функциональных групп в молекулах определяемых веществ. Как правило, интенсивность взаимодействия вещества с сорбентом возрастает с увеличением количества функциональных групп и их адсорбционной активности.

Изучением адсорбционной активности отдельных функциональных групп занимались Брокманн и Волперс, которые расположили их в следующий ряд по мере увеличения «полярности»: Cl<H<OCH3<NO2<N(CH3)2<COOCH3< Oac<NH2<OH<CONH2<COOH. Этот ряд имеет лишь информативный характер, поскольку порядок в нем зависит и от характера сорбента, и от системы растворителей.

 

Приготовление пластинок

а) С закрепленным слоем. Обычно такие пластинки заливают с помощью специальных устройств-аппликаторов. При ручном способе приготовления пластинок подобранное опытным путем количество суспензии сорбента наносят равномерным слоем на стеклянную пластинку. Равномерную толщину слоя по всей поверхности пластинки можно обеспечить, наклоняя пластинку попеременно в разные стороны. Залитые пластинки оставляют сохнуть на строго горизонтальной поверхности.

б) С незакрепленным слоем. В связи с тем, что разделительная способность пластинок с незакрепленным слоем меньше, чем пластинок с закрепленным слоем, при хроматографировании на насыпных слоях применяют пластинки несколько большего размера для увеличения пробега растворителя при проявлении. Удобнее всего работать с пластинками размером 24х10см. Увеличение длины хроматографического пробега не означает потерю времени, так как незакрепленные слои проявляются быстрее. Достаточное количество сорбента насыпают на стеклянную пластинку и с помощью шпателя сорбент разравнивают по пластинке до получения равномерного слоя. Сорбент должен быть очищен предварительно от возможных посторонних механических примесей. Шпатель можно сделать из стеклянной палочки или трубки диаметром 1см и длиной, примерно на 4см превышающей ширину слоя. Кусок трубки в двух местах на расстоянии, равном ширине будущего слоя, обматывают липкой лентой или лейкопластырем, причем число слоев определяет толщину слоя. Три слоя лейкопластыря соответствует нужной толщине слоя (примерно 0,6мм). На шпатель с одной стороны надевают кусок резиновой трубки шириной в несколько миллиметров. В момент приготовления слоя резиновый кружок упирается в боковую грань стеклянной пластинки, что обеспечивает получение равных краев слоя. В процессе приготовления слоя палочку следует передвигать, не вращая ее вокруг оси. Чтобы стеклянная пластинка при движении шпателя оставалась на месте, один её конец следует закрепить, а шпатель двигать  в сторону данной опоры. Не следует забывать, что незакрепленные слои очень непрочны. Хотя они и выдерживают наклон до 450, однако очень чувствительны к сотрясениям и резким движениям.

Нанесение образцов

В большинстве случаев пробы наносят в виде растворов в подходящем низкокипящем (50-1000С) растворителе, который должен быть относительно неполярным, чтобы хроматографируемые соединения имели  в нем низкие значения Rf. Растворы проб наносят в виде пятен на хроматографические пластинки с помощью микрошприцев или микропипеток различных типов, начиная от калибровочных пипеток  до самозаполняющихся пипеток известной емкости (рис. 2).

 

Рис. 2. Нанесение раствора образца на пластинку для препаративной ТСХ.

Концентрация пробы в растворе составляет 0,1-1%. Объем нанесенной пробы подбирают в зависимости от чувствительности обнаружения. Рекомендуется наносить как можно меньшее количество пробы, так как четкость разделения при этом увеличивается, а форма нанесенных пятен приближается к идеально круглой. Пробу наносят на расстоянии 1,5-2см от нижнего края хроматографической пластинки. Расстояние между нанесенными пробами зависит от числа проб, но обычно составляет от 1,5 до 2см. При нанесении пробы следует осторожно коснуться поверхности слоя кончиком пипетки и дать раствору впитаться в слой. В случае закрепленных слоев диаметр стартового пятна должен быть равным 3-4мм, а у насыпных слоев – 6-8мм. Нужно избегать слишком широких стартовых пятен, поскольку в этом случае пятна на хроматограмме получаются слишком большими и сливаются с близкими по Rf соседними пятнами. Достаточно хорошее разделение достигается при нанесении растворов веществ в виде узких поперечных полосок. Стартовые полоски должны быть длиной от 1 до 4см и, как можно, более узкими.

 

Хроматографирование

Процесс хроматографирования можно проводить в любом сосуде подходящих размеров, снабженном герметической крышкой. Применяются различные аквариумы, кюветы, чашки Петри различных размеров, эксикаторы, склянки для сыпучих веществ и т.д. Камера должна герметично закрываться: необходимо исключить возможность испарения растворителей, поскольку это ведет к нарушению процесса хроматографирования. В неплотно закрытых камерах существует опасность изменения многокомпонентных систем. Большинство авторов рекомендует работать с камерами, насыщенными парами системы растворителей, т.е. начинать элюирование после того, как весь объем камеры насытится парами растворителей. Скорейшему достижению равновесного состояния способствует размещение фильтровальной бумаги по трем сторонам камеры от крышки до дна. Растворитель поднимается по бумаге кверху, и пары быстро насыщают весь объем. Применение насыщенной парами растворителя камеры предупреждает образование нежелательного “краевого” эффекта, при котором одно и то же вещество в середине хроматограммы имеет более низкие значения Rf, чем по краям пластинки.

Хроматограммы чаще всего элюируют по восходящему варианту. Для закрепленных слоев используют высокие узкие камеры, насыпные слои элюируют в плоских камерах. В качестве последних годятся чашки Петри. Готовые слои на гибкой фольге даже сравнительно больших размеров можно также элюировать в узких камерах.

При погружении пластинки в элюент необходимо следить за тем, чтобы пятно на линии старта находилось выше уровня элюента в камере, иначе хроматографируемая проба будет им размыта. Во время хроматографического процесса необходимо следить за тем, чтобы фронт растворителя не дошел до верхнего края пластинки во избежание вымывания пятен. После окончания хроматографического процесса пластинку вынимают из камеры, отмечают линию фронта растворителя и сушат в сушильном шкафу или на воздухе.

Детекция пятен

Окрашенные вещества не требуют специального обнаружения, однако подавляющее большинство веществ бесцветно и поэтому их надо каким-то образом обнаруживать после элюирования. Чаще всего детекцию пятен на хроматограмме осуществляют обработкой ее растворами соответствующих реактивов, для чего ими опрыскивают пластинку из пульверизатора. Обнаружение всегда проводят в вытяжном шкафу с хорошей тягой воздуха. Необходимо помнить, что при использовании многих обнаружителей пятна сразу после обнаружения (контуры пятен) следует отметить на хроматограмме.

Методы обнаружения можно разделить на несколько групп:

 а) физические методы  применяются для обнаружения соединений, флуоресцирующих при облучении светом определенной длины волны (254 или 366нм) и нефлуоресцирующих соединений, разделенных на слоях адсорбента, содержащих флуоресцентные индикаторы. В последнем случае при УФ-облучении флуоресцирует вся неподвижная фаза за исключением зон соединений, подавляющих флуоресценцию (эти соединения обнаруживаются в виде темных пятен на флуоресцирующем фоне).

 б) химические методы применяются чаще всего. При обнаружении указанным методом хроматограмму после окончания разделения обрабатывают газами (аммиаком, йодом, бромом) или опрыскивают различными неспецифическими или специфическими обнаруживающими реагентами. Обнаружение с помощью химических реагентов очень эффективно, поскольку они часто образуют окрашенные производные сразу при опрыскивании. В отличие от бумажной хроматографии тонкослойные хроматограммы можно обнаруживать в очень жестких условиях, например, используя минеральные кислоты.

В детекции пятен органических веществ в фармацевтическом анализе часто используют:

раствор йода или пары йода, кристаллы которого находятся в эксикаторе;

1%  подкисленный  раствор калия перманганата – на светло- фиолетовом фоне появляются коричневые пятна;

 концентрированная серная  кислота – появляются темно-серые  пятна;

4) 10%  раствор  сульфата   меди   с добавлением 2% раствора аммиака для проявления диуретиков, жаропонижающих;

5) раствор Драгендорфа  – раствор KBrI4  - дает ярко-оранжевое  соединение с аминами, алкалоидами, соединениями стероидной структуры;

раствор нингидрина – для детекции пятен аминокислот;

растворы аммиака, сероводорода, йодида калия, гексоцианоферрата калия, дитизона, 8-оксихинолина – для детекции пятен, соответствующих неорганическим веществам.

 

Идентификация компонентов

После разделения веществ необходимо обнаружить их на хроматограмме. Для обнаружения бесцветных веществ, в первую очередь, следует воспользоваться физическими методами, основанными на поглощении света и флуоресценции. Для обнаружения веществ, поглощающих в УФ-области спектра, часто применяют пластинки со слоем сорбента, содержащим флуоресцирующее вещество или опрыскивают хроматограмму после разделения смеси раствором флуоресцирующего вещества. При облучении пластинки УФ-излучением вещества, поглощающие в этой области спектра, обнаруживаются в виде темных зон (пятен). Флуоресцировать в УФ-свете способно значительное количество веществ, полученные пятна имеют при этом различный оттенок. Для обнаружения флуоресцирующих веществ или веществ, поглощающих в УФ-области спектра, используют источники света с максимумами излучения в области 254 и 365 мкм. Помимо оптических методов обнаружения веществ, применяют химические методы проявления хроматограмм. К химическим методам относится использование «универсальных реагентов» и реагентов, избирательно реагирующих с определенными функциональными группами определяемых соединений.

Для количественной оценки содержания вещества в хроматографических зонах используют различные методы:

1. Определение с удалением  хроматографической зоны с пластинки можно проводить двояким образом: переносом хроматографической зоны вместе с сорбентом либо экстрагированием хроматографической зоны со слоя сорбента.

2. Определение соединений  непосредственно на пластинке  методом визуального сравнения размеров площадей пятен и их окраски с соответствующими параметрами пятен стандартных образцов

3. Метод денситометрии, повышающий точность результатов определения, основан на сканировании хроматограмм в видимом и УФ- свете с помощью «хроматографических спектрофотометров» –денситометров. Денситометры позволяют измерять поглощение света веществом на хроматограмме в режиме пропускания или отражения, а также флуоресценцию и ее тушение. Режим пропускания доступен, если только исследуемое вещество имеет полосу поглощения в видимой области спектра. В УФ-области регистрацию в режиме пропускания осуществить нельзя из-за собственного поглощения силикагеля и подложки хроматограммы.

4. Метод видеоденситометрии – сравнительно новый метод для количественной обработки хроматограмм. Принцип метода заключается во введении изображения хроматограммы в компьютер с помощью цифровой камеры с последующим сравнением интенсивностей пятен стандартных и определяемых соединений.

Количественную обработку пятна в видеоденситометрии проводят по двум характеристикам: по площади пятна и его «объему» в пространстве, при этом в качестве третьей координаты используют яркость (интенсивность окраски пятна) (рис. 3).

Рис. 3.

Вид пространственного распределения яркости в области пятна: Аi,j – значение уровня яркости точки пятна; Вi,j- значение уровня яркости точки на базовой поверхности.

5. Денситометрия с планшетным  сканером с программным обеспечением для обработки хроматограмм. Сканирование дает более четкое изображение хроматографических зон, что можно объяснить пониженным влиянием неравномерности освещения анализируемых объектов, чем в случае видеоденситометра.

 

ТСХ в современном анализе лекарственных форм.

 

Из хроматографических методов наиболее доступным, получившим наибольшее распространение в контроле лекарственных средств является тонкослойная хроматография.

С развитием аппаратурного оформления и появлением новых материалов увеличились возможности ТСХ, и теперь этот вариант хроматографии может конкурировать в качестве независимого метода при решении проблем идентификации вещества. С появлением новых микрогранулированных и весьма гомогенных носителей для ТСХ существенно повысилась разрешающая способность метода. Этому также способствовала разработка способов автоматизированного нанесения на пластинки микроколичеств препарата и новых вариантов метода, например циркуляционной ТСХ. Совокупность этих новых приемов иногда называется высокоэффективной ТСХ (ВЭТСХ).

Метод хроматографии в тонком слое сорбента применили в фармацевтическом анализе для разделения экстрактов и настоек лекарственных растений советские ученые Н. А. Измайлов и М. С. Шрайдер (1938).

ТСХ имеет то преимущество, что позволяет разделять сложные лекарственные смеси на отдельные компоненты, близкие по химической структуре и свойствам, например, смеси аминокислот, алкалоидов, барбитуратов, сульфаниламидов и др.

Особенно удобен этот метод для анализа малых количеств ядовитых и сильнодействующих веществ в прописи, когда определение их химическими методами затруднено. ТСХ часто позволяет разделить близкие по структуре соединения, например такие, как геометрические изомеры и члены одного гомологичного ряда.