ТСХ в современном анализе лекарственных форм

 

Введение

Основы тонкослойной хроматографии     3

Сорбенты          6

Растворители (элюенты)       9

Приготовление пластинок       11

Хроматографирование        13

Детекция пятен         14

Идентификация компонентов      16

ТСХ в современном анализе лекарственных форм   18

Литература

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 

Хроматография – физико-химический метод разделения и анализа смесей газов, паров, жидкостей или растворенных веществ сорбционными методами в динамических условиях. В основе метода лежит явление адсорбции ионов из растворенных веществ на поверхности твердых сорбентов. Сущность хроматографии заключается в том, что процесс разделения веществ происходит между двумя фазами, одна из которых движется относительно другой. При своем перемещении каждое хроматографируемое вещество постоянно перераспределяется между обеими фазами так, что только часть его движется вперед вместе с подвижной фазой.

Среди современных хроматографических методов, в значительной степени способствовавших развитию анализа органических и биоорганических соединений и совершенствованию способов препаративного разделения, заметное место занимает тонкослойная хроматография (ТСХ).

С помощью хроматографии можно разделять и определять сложные смеси органических и неорганических веществ, достаточно быстро проводить очистку, идентификацию и концентрировать вещества при достаточной простоте технических приемов. Кроме того, метод высоко эффективен и чувствителен, сочетается с другими физико-химическими методами. Благодаря этим достоинствам метод широко применяется  в фармацевтическом анализе.

 

 

 

 

 

 

Основы тонкослойной  хроматографии

 

В методе ТСХ хроматографирование веществ происходит в тонком слое сорбента, нанесенного на твердую плоскую подложку. Разделение в этом методе в основном происходит на основе сорбции-десорбции. Использование различных сорбентов, позволило значительно расширить и улучшить этот метод. В начале появления метода пластины приходилось изготавливать самостоятельно. В настоящее время используются пластины заводского изготовления, имеющие достаточно широкий ассортимент как по размерам и носителям, так и по подложкам. Современная хроматографическая пластинка (рис. 1) представляет собой основу из стекла, алюминия или полимера (например политерефталат). В связи с тем, что стеклянная основа становится менее популярной (часто бьется, нельзя разделить пластинку на несколько частей не повредив слой сорбента, тяжелая по весу), наибольшее распространение получили пластины, в качестве основ которых используют алюминиевую фольгу или полимеры. Для закрепления сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль и др., которые удерживают зерна сорбента на подложке. Толщина слоя может быть различна (100 и более мкм), но самый важный критерий - слой должен быть равномерный по толщине в любом месте хроматографической пластинки.

Рис. 1 Пластинка TСХ:

 

 

 

В процессе разделения тонкослойной хроматографией анализируемая смесь перемещается вместе с подвижной фазой по тонкому слою порошкообразного сорбента. По направлению движения подвижной жидкой фазы плоскостная хроматография подразделяется на восходящую, нисходящую и горизонтальную. В ТСХ наиболее часто используют восходящий вариант. При этом может осуществляться прием одномерной и двумерной подачи элюента.

● Одномерная хроматография.

Во многих случаях при однократной подаче элюента по тонкослойной пластинке не происходит полного разделения хроматографических пятен. Эффективность разделения может быть улучшена при удлинении пути пробега хроматографических зон и элюента.  Такое условие может быть осуществлено при многократной подаче элюента. Каждый раз подвижная фаза пропускается через пластинку после ее высушивания, т.е. после удаления предварительно поданного элюента. В случае, если с одной и той же по составу подвижной фазой не происходит полного разделения хроматографических зон, можно произвести замену элюента. Такой прием называется ступенчатой хроматографией, при которой через хроматографическую пластинку вначале пропускают одну подвижную фазу, а затем после ее удаления, помещают в камеру с другой. При этом повышается эффективность разделения смесей веществ.

● Двумерная хроматография.

В ТСХ с закрепленным слоем для повышения разделяющей способности пластинки применяется вариант двумерной хроматографии. Принцип аналогичен ступенчатому разделению смеси. Для этого хроматографическая пластинка после прохождения первого элюента подсушивается, а затем ее помещают  в хроматографическую камеру так, чтобы направление второй подвижной фазы было перпендикулярно направлению первого элюента.

При хроматографировании в тонком слое применяют два основных типа пластинок: с закрепленным и незакрепленным (насыпным) слоями. Пластинки с закрепленным слоем готовят, заливая их суспензией сорбента в воде или органическом растворителе. К суспензии обычно добавляют связующее вещество для закрепления слоя. Пластинки с незакрепленным слоем готовят из сухого сорбента, разравнивая его по стеклянной пластинке до получения слоя одинаковой толщины.

 

Сорбенты

Вещества, применяемые в качестве сорбентов в тонкослойной хроматографии, должны удовлетворять нескольким основным требованиям: они не должны растворяться в хроматографических растворителях, должны быть химически инертными по отношению к элюирующим системам и хроматографируемым соединениям и должны обладать высокой адсорбционной способностью.

Наибольшее распространение в качестве сорбента в ТСХ получили силикагель и оксид алюминия. Они, за редким исключением, пригодны для разделения самых различных типов соединений, т.е. являются универсальными сорбентами. Они доступны, недороги, обладают замечательной разделительной способностью. Кроме того, эти сорбенты удобны тем, что можно регулировать их активность, менять рН, зернение и т.д.

Силикагель (кремнезем). Его получают из солей кремневой кислоты. Внутренняя поверхность силикагеля энергетически неоднородна из-за наличия нескольких типов беспорядочно распределенных ОН-групп. Кроме ОН-групп наиболее важную роль в адсорбционных процессах играют поверхностные силоксановые группы. Они могут образоваться в результате конденсации реакционоспособных ОН-групп в процессе активации силикагеля при повышенных (200-4000 С) температурах.

Размер пор представляет важную характеристику силикагеля как сорбента. Размеры пор меняются от 20 до 150Ао, а удельная поверхность - от 300 до 600м2/г. От размеров его частиц зависит скорость элюирования: на силикагеле с большими частицами она выше. Размер частиц силикагеля для ТСХ равен 2-40мкм. Необходимо отметить, что с увеличением размеров частиц уменьшается четкость разделения.

В качестве связующего вещества при хроматографировании чаще всего добавляют от 5 до 15% гипса. В этом случае удается получить лучшее разделение. Однако благодаря очень маленькому размеру частиц силикагель и без связующего  вещества образует хорошо прилипающие слои и может использоваться почти без ограничений для хроматографирования большинства соединений.

Оксид алюминия. Характеризуется высокой адсорбционной активностью и его легко обрабатывать. Выпускают три вида оксида алюминия: щелочной, нейтральный и кислый. При правильном применении и соответствующей степени активности оксида алюминия на нем можно успешно разделять большинство соединений.

Оксид алюминия получают частичной гидратацией (прокаливанием при 200-6000С) гидроксидов, получаемых, например, при обработке раствора алюмината натрия диоксидом углерода. Он пригоден для разделения не слишком полярных стереоизомеров или соединений с различными функциональными группами, особенно способных образовывать внутримолекулярные водородные связи. Активность товарных образцов различна, ее определяют  с помощью азокрасителей, применяя метод Брокмана и Шоддера или метод ТСХ.

Силикат магния. Синтетический силикат магния поступает в продажу под названием «флоризил» или «магнезол». Силикат магния выпускают в виде частиц размером от 2 до 44мкм, его рН равен примерно 10. Обычный товарный сорбент не содержит ни связующего, ни флуоресцентного индикатора.

Силикат магния можно использовать для разделения сахаров, их ацетатов, стероидов, эфирных масел, липидов и гликозидов.

Целлюлоза. Целлюлоза относится к числу наиболее часто применяемых органических сорбентов. В ТСХ используется два типа целлюлозы: природную волокнистую и микрокристаллическую. Длина волокон природной целлюлозы составляет  от 2 до 25мкм, а средняя степень полимеризации колеблется между 400 и 500. Частицы микрокристаллической целлюлозы крупнее: от 20 до 40мкм, а средняя степень полимеризации ниже: от 40 до 200. Благодаря применению очень коротких волокон целлюлозы в форме порошка в ТСХ не получается такое быстрое растекание хроматографируемых веществ вдоль волокон, которое имеет место на целлюлозе, используемой в виде хроматографической бумаги, и поэтому при одних и тех же концентрациях ТСХ дает более четкие пятна и позволяет получить лучшее разделение, чем бумажная хроматография. На чистой целлюлозе проводят, главным образом, количественный анализ или разделение фосфорных кислот, фосфатов и т.п. Большинство марок товарной целлюлозы выпускают без связующего вещества, поскольку адгезионные свойства ее слоев намного выше, чем у неорганических сорбентов. В некоторые марки добавляют флуоресцентный индикатор.

Готовые хроматографические пластинки. Помимо перечисленных выше сорбентов в ТСХ применяются готовые хроматографические пластинки, которые в настоящее время производятся в большом ассортименте во всем мире и находят все большее применение. Стеклянные пластинки с тонкими слоями сорбентов (прежде всего с силикагелем, окисью алюминия и целлюлозой) поставляют фирмы Merck, Scheicher and Schiill, Camag и др. Однако гораздо удобнее пользоваться готовыми слоями, нанесенными на алюминиевую фольгу или на гибкую фольгу из пластмассы. Преимущество фирменных пластинок бесспорно. Их не требуется предварительно готовить. Они тщательно упакованы, хранятся неограниченно долго, обладают механической прочностью, изготовлены из качественных материалов достаточной чистоты, обладающих высокой разделительной способностью. Благодаря своим прекрасным механическим свойствам готовые пластинки на фольге объединяют в себе все преимущества ТСХ с удобствами работы на хроматографической бумаге.

В Чехии предприятием Kavalier производятся гибкие пластинки с силикагелем с добавкой люминофора, называемые «Силуфол УФ254». В качестве связующего вещества используется крахмал. «Силуфол» можно резать для получения пластинок любого размера, также выпускаются готовые пластинки с окисью алюминия – «Алуфол». В нашей стране выпускаются готовые пластинки с силикагелем с добавкой люминофора и без него, называемые «Армсорб», «Сорбфил» и другие.

Вышеперечисленные сорбенты являются наиболее распространенными, помимо этих существуют множество веществ, используемых как сорбенты. Это тальк, сульфат кальция, крахмал и т.д. В то же время даже уже указанные сорбенты могут быть модифицированы для придания им новых сорбционных свойств (пропитка сорбентов реактивами, например AgNO3, создание пластин с обращенной фазой). Именно такое разнообразие возможных фаз при минимальных затратах позволяют использовать ТСХ для хроматографирования огромного числа веществ.

 

Растворители (элюенты)

В ТСХ растворитель или система растворителей осуществляет перенос хроматографируемых соединений. Для хорошего разделения соединений, особенно с резко различающейся полярностью, необходима подвижная фаза с возрастающей элюирующей способностью. На элюирующую способность влияют следующие три фактора: 1) взаимодействие между молекулами растворителя и хроматографируемого соединения, 2) взаимодействие между адсорбированными молекулами пробы и молекулами растворителя, 3) взаимодействие между адсорбированными молекулами растворителя и адсорбентами.

При подборе растворителей следует руководствоваться общим правилом: подобное растворяет подобное. Если анализируемые соединения значительно отличаются от растворителя по гидрофильным свойствам или полярности, то нельзя ожидать хороших результатов. Такие соединения или останутся на стартовой линии или будут перемещаться вместе с фронтом растворителя. Растворители обычно классифицируют по элюотропным рядам. Если элюирующая способность растворителя заранее не определена экспериментально, то следует руководствоваться следующим основным принципом, применимым также при определении полярности или гидрофильности растворенных веществ: алифатические углеводороды считаются крайними членами ряда, потому что они наиболее липофильны и неполярны, а замыкает такой ряд вода, поскольку она наиболее гидрофильна и является высокополярным растворителем.

Элюотропный ряд –  ряд растворителей, расположенных в порядке увеличения эффективности вытеснения ими адсорбированных соединений с данного сорбента. Наиболее известен ряд Траппе, который выглядит следующим образом (в порядке увеличения элюирующей способности): петролейный эфир < циклогексан < тетрахлорметан < трихлорэтилен < толуол < бензол < дихлорметан < хлороформ < эфир < этилацетат < ацетон < н-пропанол < этанол < метанол.

Как показывает практика, разрешающая способность системы растворителей максимальна в области Rf =0,5 и уменьшается как в сторону старта, так и в сторону фронта (величина Rf характеризует способность вещества перемещаться в тонком слое сорбента и представляет собой отношение расстояния, пройденного растворенным веществом, к расстоянию, пройденному растворителем). В связи с этим для проведения хроматографического разделения данной смеси веществ следует пользоваться такой системой растворителей, в которой зоны отдельных компонентов располагались бы симметрично и вблизи линии с Rf =0,5.