Основные положения биофармацевтического анализа

В соответствии с современными представлениями метаболические процессы условно делят на две фазы. В первой фазе в результате процессов окисления, восстановления или гидролиза изменяется молекула ЛВ с образованием функциональных групп, имеющих активные атомы водорода (оксигруппы, карбоксигруппа, первичные и вторичные аминогруппы и др.). Во второй фазе происходит процесс конъюгации образовавшихся функциональных групп с высокополярными кислотными остатками глюкуроновой, серной кислот, некоторыми аминокислотами и др. В результате этого процесса гидрофильность молекул метаболитов возрастает настолько, что они легко выводятся с мочой. Не все ЛВ метаболизируются по указанной двухфазной системе. Некоторые из них образуют конъюгаты, минуя первую фазу, другие после первой фазы выводятся почками без последующей конъюгации.

На биотрансформацию ЛВ влияют пол, возраст, условия жизни, характер питания, заболевания и т.д. Кроме влияния различных заболеваний, возможны также индивидуальная вариабельность кинетики метаболизма, индукция и угнетение метаболизирующих ферментов. Все это свидетельствует о том, что биотрансформация ЛВ является чрезвычайно сложным процессом, зависящим от многих экзогенных и эндогенных факторов. Исследование механизма процессов метаболизма - проблема, которая входит в круг задач различных областей химических, биологических, фармацевтических наук, в том числе фармацевтической химии.[6,19,21]

 

 

 

 

 

 

 

ГЛАВА II. МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В   БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

В процессе проведения биофармацевтического анализа необходимо проводить идентификацию и количественное определение лекарственных веществ и их метаболитов в биологических жидкостях таких, как моча, слюна, кровь и др. Только применение высокочувствительных и недеструктивных методов позволяет провести биофармацевтические исследования. К таким методам в первую очередь относятся физико-химические методы анализа.

Правильный  выбор метода  определения  концентрации  во многом определяет успешное решение всей задачи исследования.  Требованиям,  предъявляемым  к  биофармацевтическому  анализу, отвечают  только  чувствительные  физико-химические  методы. Классические химические  методы  анализа  (гравиметрические  и  титриметрические)  из-за низкой чувствительности для этой цели непригодны.  Существуют различные классификации физико-химических методов.[14]

По одной из них (Беликов В.Г., 1987) все эти методы подразделяются на следующие группы:

1. Оптические методы (рефрактометрия, интерферометрия, поляриметрия).
2. Методы, основанные на поглощении излучения (абсорбционные методы) – ультрафиолетовая спектрофотометрия, фотометрия, фотоколориметрия, колориметрия, фототурбидиметрия, фотонефелометрия, инфракрасная спектроскопия, спектроскопия комбинационного рассеяния, атомно-адсорбционная спектрофотометрия, рентгеновская абсорбционная спектроскопия.
3. Методы, основанные на испускании излучения – люминесцентные  методы (флуориметрия, хемилюминометрия), атомно-эмиссионная  спектроскопия, радиохимические (радиоизотопные) методы, рентгеновская флуоресценция, экстракционно-флуоресцентный  анализ.
4. Методы, основанные на использовании магнитного поля - ЯМР-спектроскопия (ядерного магнитного резонанса), масс – спектрометрия.
5. Электрохимические методы – потенциометрия, полярография, кулонометрия, кондуктометрия.
6. Термические методы – термография, термофрактография, калориметрия.
7. Методы разделения – экстракция, хроматографические методы, электрофорез.

      Процесс выполнения биофармацевтического анализа включает несколько последовательно выполняемых стадий:

• экстракцию из биологической жидкости;
• разделение;
• идентификацию; 
• количественное определение лекарственного вещества или его метаболитов. 

ЭКСТРАКЦИЯ – процесс распределения вещества между двумя несмешивающими жидкими фазами (органический растворитель – вода). Для проведения экстракции к воде добавляют экстрагент - органический растворитель, малорастворимый или нерастворимый в воде, и смесь взбалтывают для ускорения распределения растворенных веществ между двумя жидкостями. Перед  экстракцией необходимо  осадить белки (сульфатом аммония, раствором трихлоруксусной  или хлорной кислоты). Надосадочную жидкость декантируют и экстрагируют из нее испытуемые вещества. При необходимости кровь перед экстракцией подвергают консервированию гепарином или гемолизации раствороми сапонинов.

Процессы экстракции анализируемых лекарственных веществ и их метаболитов из биологических объектов осуществляют с помощью таких органических растворителей, как диэтиловый эфир, хлороформ, бензол и др.

Нередко сочетают в экстрагенте два растворителя, например хлороформ и гексан, циклогексан и н-бутанол и др. Такой способ называют двухфазным экстрагированием.

Наилучшая полнота разделения достигается, если последовательно извлекают из биологической жидкости лекарственное вещество или его метаболиты несколькими растворителями, например эфиром, этилацетатом, хлороформом, ацетоном, водой.

Экстракцию проводят в присутствии кислот, щелочей или буферных растворов, создавая рН среды, оптимальное для извлечения лекарственного вещества или его метаболита. Иногда сочетают экстракцию органическим растворителем с последующей реэкстракцией (растворами едких щелочей или кислот).[17,19]

Вещества, содержащиеся в полученных экстрактах (реэкстрактах), определяют  с помощью физико-химических методов анализа.

 

                           2.1. Хроматографические методы анализа

  Хроматографией  называется  процесс  разделения  смесей  веществ,  основанных  на количественных  различиях  компонентов  при  их  непрерывном  перераспределении  между  контактирующими  фазами, одна  из  которых  неподвижна,  а  другая  имеет постоянное  направление  движения.

В основу классификации многочисленных хроматографических методов положены следующие признаки:

• агрегатное состояние фаз;
• механизм взаимодействия сорбент – сорбат;
• способы проведения хроматографического анализа;
• аппаратурное оформление (техника выполнения) процесса хроматографирования;
• цель хроматографирования

По агрегатному состоянию фаз хроматографию разделяют на газовую и жидкостную. Газовая хроматография включает газожидкостную и газотвердофазную, жидкостная – жидкостно-жидкостную и жидкостно-твердофазную. Первое слово в названии метода характеризует агрегатное состояние подвижной фазы, второе – неподвижной.

По механизму взаимодействия сорбента и сорбата можно выделить несколько видов хроматографии:

• адсорбционная основана на различии в адсорбируемости веществ твердым сорбентом
• распределительная основана на различной растворимости разделяемых веществ в неподвижной фазе или на различной растворимости веществ в подвижной и неподвижной фазах
• ионообменная хроматография – на разной способности веществ к ионному обмену
• эксклюзионная хроматография – на различии в размерах и формах молекул разделяемых веществ;
• аффинная хроматография – на специфических взаимодействиях, характерных для некоторых биологических и биохимических процессов (например, антитело и антиген, гормон и рецептор и др.)

Существует осадочная хроматография, основанная на образовании отличающихся по растворимости осадков разделяемых веществ с сорбентом, адсорбционно-комплексообразовательная, основанная на образовании координационных соединений разной устойчивости в фазе или на поверхности сорбента, и др. Следует помнить, что классификация по механизму взаимодействия весьма условна: ее используют в том случае, если известен доминирующий механизм.

По технике выполнения выделяют колоночную хроматографию, когда разделение проводится в специальных колонках, и плоскостную хроматографию, когда разделение проводится на специальной бумаге (бумажная хроматография) или в тонком слое сорбента (тонкослойная хроматография).

В колоночной хроматографии используют насадочные или капиллярные колонки. Насадочную колонку заполняют сорбентом (насадкой), а внутреннюю стенку капиллярной колонки покрывают пленкой жидкости или пылью адсорбента.

В зависимости от цели проведения хроматографического процесса различают:

- аналитическую хроматографию (качественный и количественный анализ); -  препаративную хроматографию (для получения веществ в чистом виде, для концентрирования и выделения микропримесей);

- промышленную (производственную) хроматографию для автоматического управления процессом (при этом целевой продукт из колонки поступает в датчик).[4,17]

Классификация по способам проведения анализа подразделяет хроматографию на три вида:

1) фронтальный;

2) проявительный;

3) вытеснительный 

 

Тонкослойная хроматография (ТСХ) широко применяется в биофармацевтическом анализе, ввиду высокой разрешающей способности и чувствительности (рис.2.1).

 

 

 

 

 

                              Рис.2.1. Тонкослойная хроматография

    Повысить разрешающую способность тонкослойная хроматография можно, используя метод двумерной хроматографии. Тонкослойная хроматография отличается простотой выполнения, однако при анализе сложных смесей, содержащих большое число компонентов, этот метод не всегда позволяет достигнуть нужного эффекта. Биофармацевтический анализ  методом ТСХ чаще всего сочетают с УФ-спектрофотометрией и флуоресцентным методом (хроматоспектрофотометрия, хроматофлуоресценция).[4]

Газовая хроматография (ГФ) и широко применяемый ее вариант – газожидкостная хроматография (ГЖХ) – ввиду высокой чувствительности, хорошей воспроизводимости и точности стоят на одном из первых мест среди физико-химических методов, используемых для анализа лекарственных веществ и их метаболитов в биологических жидкостях. Главным прибором для этого метода исследований является газовый хроматограф (рис.2.2.).

 

              

Рис.2.2. Принципиальная схема газового хроматографа:

1 – система подготовки газов; 2 – система дозирования;

3 – устройство для ввода  пробы; 4 – хроматографическая колонка; 5 – система

 детектирования; 6 – блок питания  детектора; 7 –регистратор; 8 – измеритель  скорости  потока газа-носителя

 

 Газовая хроматография  позволяет определить микрограммовые и нанограммовые количества этих веществ. Непосредственное введение биологической жидкости в хроматографическую колонку, как правило, не дает положительных результатов. До выполнения анализа методом газовой хроматографии необходимо осуществлять многократную экстракцию (чаще эфиром, хлороформом или этилацетатом) лекарственного вещества или его метаболитов.[5]

Высокоэффективная или высокоскоростная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) отличается от газовой хроматографии тем, что позволяет испытывать соединения, обладающие термической неустойчивостью и молекулярной массой более 400. Для этих соединений исключается фаза перевода в летучие производные. Для идентификации лекарственного препарата исследуются в первую очередь экстракты из мочи и желчи, поскольку, как правило, в этих объектах лекарственные препараты присутствуют в высоких концентрациях. Для количественного определения исследуем экстракты из крови, поскольку только для крови имеются данные по терапевтическим, токсическим и летальным дозам. Жидкость-жидкостная экстракция в делительных воронках, применяемая в настоящее время, имеет ряд недостатков: необходим большой объем биожидкости (до 100 мл), большой расход реактивов, многостадийность, длительность (кровь при подкислении и подщелачивании образует с экстрагентами стойкую суспензию), неточность. Поскольку для исследования методом ВЭЖХ необходимо всего 5-10 мкл пробы, нами исследована возможность проведения однократной экстракции лекарственных препаратов из одной пробы крови (мочи и желчи) объемом 0,6 мл в пробирках «Эппендорф». Предлагаемый метод имеет ряд преимуществ: значительно снижает трудоемкость анализа, снижает стоимость анализа за счет уменьшения объемов используемых реактивов, сокращает случайные и систематические ошибки в процессе подготовки проб, избирателен и чувствителен. По сравнению с тонкослойной хроматографией метод ВЭЖХ требует меньших затрат времени на выполнение анализа. Это обусловило широкое внедрение метода в практику биофармацевтического анализа.[14,16]

                2.2.Фотометрические методы анализа

   Наиболее часто в биофармацевтическом анализе используют фотометрические методы анализа. Фотометрические методы анализа основаны на избирательном поглощении электромагнитного излучения анализируемым веществом и служат для исследования строения, идентификации и количественного анализа светопоглощающих соединений.

 

 

 

     В зависимости от используемой аппаратуры в фотометрическом анализе различают спектрофотометрические методы – анализ по поглощению веществами монохроматического излучения (спектрофотометрия, в УФ-, видимой и ИК-областях спектра); фотоколориметрические – анализ по поглощению веществами немонохроматического излучения (фотоколориметрия, экстракционная фотоколориметрия).

Сравнительно редко в биофармацевтическом анализе используют фотоколориметрию.  Этот  метод применяют главным образом тогда, когда нужно определить большие концентрации лекарственного вещества или сумму лекарственного вещества и метаболитов, содержащихся в биологической жидкости. Недостаток использования фотоколориметрических методик заключается в сравнительно невысокой их точности.