Обращенные мицеллы ПАВ- модель биологических мембран

В качестве мицеллообразователей могут выступать липиды и многочисленные детергенты [15, 24], которые можно разделить на группы: катионные (например, ЦТАБ или МТОАХ), 2) анионные (например, АОТ), 3) нейтральные (например, Твин-20, Тритон Х-45, Бридж 56 и т. д.). В зависимости от того, к какой группе принадлежит ПАВ, полярное ядро обращенной мицеллы может нести положительный или отрицательный заряд или не иметь заряда. В качестве неполярных органических растворителей обычно используют бензол, гексан, гептан, октан, декан, циклогексан, хлороформ, силиконовое масло, эфир [23, 24].

а                                   б     

Рис.4. Структурная организация липидов в средах разной полярности: а — прямая мицелла ПАВ в водной среде; б—обращенная мицелла ПАВ в углеводороде.

При подборе ПАВ необходимо учитывать, что их физико-химические свойства должны соответствовать свойствам фаз. В кислой среде должны применяться катионные ПАВ, в щелочной — анионные, а при значительных концентрациях соли в полярной фазе лучше использовать нейтральные ПАВ. Неполярный характер непрерывной фазы предъявляет определенные требования к геометрии молекулы ПАВ, выбранного для приготовления обращенных мицелл: 1) часть молекулы ПАВ, находящаяся в неполярной фазе, должна иметь больший диаметр, чем часть молекулы, образующая полярное ядро мицеллы.2)высокоэффективные ПАВ должны иметь «сильные» липофильные и гидрофильные группы. Такие ПАВ отличаются малой истинной растворимостью в воде и углеводороде, но обладают по отношению к ним высокой солюбилизационной емкостью[3].

Методы приготовления  обращенных мицелл просты и заключаются в растворении ПАВ в органическом растворителе в необходимой концентрации, после чего добавляют водный раствор белка, «озвучивают» или интенсивно перемешивают систему. Образуется оптически прозрачный раствор, отличающийся довольно высокой устойчивостью [23, 24].

Обращенные мицеллы включают в свои полярные ядра белки, имеющие одну субъединицу (трипсин, альбумин, цитохрома C) и несколько субъединиц (каталаза, пируваткиназа, лактатдегидрогеназа). Молекулярные массы солюбилизированных белков характеризуются широким диапазоном: от 12 000 для цитохрома b₅ до 340 000 Да для пируваткиназы. Примечательно, что обращенные мицеллы могут солюбилизировать не только водорастворимые белки, но и ферменты с ярко выраженными поверхностно-активными свойствами (фосфолипаза и липаза), а также гидрофобные мембранные белки (цитохром b₅ и цитохром Р-450 ЛМ-2), т. е. доказана возможность включения в обращенные мицеллы белковых объектов самой различной природы и функций. В большинстве случаев солюбилизированные мицеллами ферменты и белки сохраняют свои функции [24].

 2.1.Свойства обращенных мицелл ПАВ.

Мицеллы АОТ в настоящее  время наиболее изучены. Структура обращенных мицелл АОТ мало зависит от природы углеводородного растворителя и от концентрации АОТ, а определяется в основном содержанием воды в системе, т. е. соотношением [H₂O]/[АОТ] = n. С увеличением степени гидратации резко возрастает молекулярная масса, число агрегации и размер обращенных мицелл. При n=0 число агрегации мицелл АОТ в октане составляет 15 —20 молекул (молекулярная масса —10 000 Да), а при n=40—50 число агрегации достигает нескольких сот и молекулярная масса возрастает до 10⁶ [25]. При малом содержании воды обращенные мицеллы АОТ несколько асимметричны, но при существенном увеличении становятся практически сферическими. Но иногда при любых значениях n мицеллы АОТ в гептане или декане являются эллипсоидами с соотношением осей 1 :2 [26].

Структура белоксодержащих обращенных мицелл АОТ была изучена методом скоростной седиментации в работах К. Мартинека и сотр. [27]. Для каждой степени гидратации мицелл АОТ характерна строгая монодисперсность, подтвержденная одной четкой границей на седиментограммах [27], но при солюбилизации белка появляется вторая граница на седиментограмме, соответствующая заполненной мицелле. Легкая фракция мицелл соответствует «пустым», а тяжелая фракция− белоксодержащим мицеллам, которые также строго монодисперсны. Главные выводы седиментационного анализа обращеных мицелл АОТ в октане, включающих α-химотрипсин, сводятся к следующему [27]: 1) внутренняя часть белоксодержащнх мицелл имеет размеры, близкие к размерам молекулы α-химотрипсина; 2) число агрегации в таких мицеллах постоянно и равно числу агрегации в «пустых мицеллах при n = 11,6); 3) степень гидратации АОТ в белоксодержащей мицелле та же, что и в «пустых» мицеллах при той же их увлажненности.

Анализ данных по седиментации обращенных мицелл АОТ в октане, содержащих химотрипсин, лизоцим, трипсин, алкогольдегидрогеназу, яичный альбумин и γ-глобулин, позволил К. Мартинеку и соавт. [27] сделать заключение, что молекула белка встраивается во внутреннюю полость мицеллы в стехиометрическом соотношении 1:1, не оказывая при этом существенного влияния на внешние размеры обращенной мицеллы. При низких степенях гидратации ПАВ, когда внутренняя полость обращенной мицеллы меньше эффективного радиуса солюбилизированного белка, он создает вокруг себя мицеллу необходимого размера из меньших пустых мицелл.

Ясно, что седиментационный анализ позволяет лишь косвенно судить о структуре белоксодержащих мицелл АОТ. Он ничего не говорит о структурных изменениях, происходящих с молекулами белков в обращенных мицеллах[3].

   3.ОПТИМАЛЬНЫЕ УСЛОВИЯ СОЛЮБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ ОБРАЩЕННЫМИ МИЦЕЛЛАМИ ПАВ.

Наиболее удобно исследовать влияние оптимальных условий на стабильность и структурную организацию солюбилизированных белков на примере гемопротеидов. Они имеют природную метку — гем. Это облегчает контроль за состоянием белка, так как спектральные характеристики гемопротеидов (максимумы и интенсивность полосы Соре, спектры флуоресценции и кругового дихроизма) отражают изменения, происходящие с белками, и воздействия среды на них. В спектрах поглощения цитохромов Р-450 ЛМ-2, b₅ и миоглобина в обращенных мицеллах ПАВ наблюдается сдвиг максимумов полос Соре после включения гемопротеидов в обращенные мицеллы. Величина сдвига максимума полосы Соре сильно зависит от состава обращенных мицелл (табл. 1).Сдвиг полосы Соре в спектрах поглощения, как правило, происходит в момент включения гемопротеида в обращенные мицеллы. Уменьшение интенсивности полосы Соре происходит во времени.

Для количественной характеристики изменения интенсивности полосы Соре гемопротеидов используют константы скорости первого порядка к в с^-1, которые определяли из зависимости lg(ΔD/ΔD₀) от времени, где ΔD₀ и ΔD — интенсивность поглощения гемопротеидов в начальный момент и после определенного промежутка времени соответственно. Поскольку в большинстве случаев каталитическая активность гемопротеидов прямо связана с интенсивностью поглощения в области полосы Соре, следовательно константа скорости к  является количественной мерой скорости инактивации гемопротеидов[3].

Таблица 1.Константы скорости инактивации цитохрома Р-450 в

обращенных мицеллах ПАВ в октане при 30˚ [28,29]

Примечание. Объем 0,05 М калий-фосфатного буфера, рН 6,6.

Во времени уменьшается  каталитическая активность и поглощение в области полосы Соре, что означает структурную трансформацию этих белков с потерей гема. После добавления водного раствора белка в "сухой" раствор ПАВ наиболее быстро формируется "безбелковые" или "пустые" обращенные мицеллы, а с белковой глобулой остается лишь прочно связанная вода. На этой стадии солюбилизации белок наиболее доступен для углеводорода. Поэтому первая фаза, легко регистрируемая спектрально, характеризуется наибольшими значениями константы скорости инактивации. В течении 3-4 минут вокруг белковой глобулы формируется оболочка из молекул ПАВ. Однако доступность белка для углеводорода постоянно изменяется. Периодичность связана со сложными кооперативными превращениями системы, когда нарушается целостность оболочки из молекул ПАВ вокруг белка и увеличивается его доступность для углеводорода[30].

 Таким образом, это  многофазный процесс, в котором  с помощью спектральной регистрации можно различить до трех фаз. Ниже рассмотрены факторы, влияющие на константы скорости изменения интенсивности полос Соре гемопротеидов в обращенных мицеллах ПАВ.

Концентрация белка. Устойчивость цитохрома b₅ в мицеллах АОТ при постоянном соотношении [Н₂О]/[АОТ] увеличивается с ростом концентрации белка в системе до 4 мкМ, после чего стабильность цитохрома b₅ практически не изменяется. Повышение устойчивости связано с тем, что в агрегатах белок в большей степени защищен от влияния углеводородного окружения. При больших концентрациях белка его термическая инактивация в мицеллах характеризуется только одной фазой, в то время как при малых концентрациях (0,68 мкМ) проявляются две фазы инактивации белка — быстрая и медленная [31].

Соотношение [Н₂О]/[АОТ]. Размер обращенной мицеллы определяется соотношением воды и детергента. Максимальная стабильность цитохромов Р-450 и b₅ в мицеллах наблюдается при концентрации АОТ 0,25 М. Использование смешанных мицелл, составленных из АОТ и Тритона Х-45 в соотношении 1:2, не меняет оптимума по суммарной концентрации двух ПАВ. При значениях n≈10 достигается максимальная устойчивость цитохрома в мицеллах, а интенсивность и максимум полосы Соре практически не отличаются от этих характеристик цитохрома b₅ в буферном растворе. При отклонении от оптимального значения n в ту или другую сторону наблюдается небольшой сдвиг в коротковолновую область максимума полосы Соре на 3—6 нм и уменьшение интенсивности поглощения. С увеличением содержания воды в мицеллах от 3 до 6% константа скорости инактивации цитохрома Р-450 уменьшается обратно пропорционально содержанию воды, т. е. с ростом влажности мицелл устойчивость цитохрома Р-450 увеличивается[3]. По-видимому, в этих условиях мицеллобразователь тратится в основном на солюбилизацию воды, а с белком остается минимальное количество ПАВ[30]. Наличие оптимума по [Н₂О]/[ПАВ] характерно не только для гемопротеидов, но и для ферментов других классов. Каталитическая активность пирофосфатазы в реакции гидролиза пирофосфата максимальна при соотношении n=10 [32].

Состав обращенных мицелл. Из табл. 1 следует, что в обращенных мицеллах разного состава наблюдаются две фазы инактивации цитох<span class="dash041e_0441_043d_043e_0432_043d_043e_0439_0020_0442_0435_043a_0441_04425__Char" style=" font-family: 'Verdana', 'Arial'; font-size: 1