Обращенные мицеллы ПАВ- модель биологических мембран

 

Содержание.

 

Содержание. 2

Список использованных сокращений 3

Введение. 4

1.УЛЬТРАСТРУКТУРА БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН. 6

1.1.Белки. 6

1.2.Липиды. 6

2. ОБРАЩЕННЫЕ МИЦЕЛЛЫ ПАВ В ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ И ИХ СВОЙСТВА. 10

3.ОПТИМАЛЬНЫЕ УСЛОВИЯ СОЛЮБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ ОБРАЩЕННЫМИ МИЦЕЛЛАМИ ПАВ. 13

4.СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ, СОЛЮБИЛИЗИРОВАННЫХ ОБРАЩЕННЫМИ МИЦЕЛЛАМИ ПАВ. 16

4.1.Электронные спектры поглощения. 16

4.2.Спектры кругового дихроизма (КД). 18

4.3.Триптофановая флуоресценция. 18

5.ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СОЛЮБИЛИЗИРОВАНЫХ МИЦЕЛЛАМИ БЕЛКОВ С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ЛИГАНДАМИ. 21

6.ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ В ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛАХ ПАВ. 23

7. ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ МИЦЕЛЛЯРНОЙ ЭНЗИМОЛОГИИ. 27

Выводы. 30

Список использованной литературы. 31

 

 

 

Список  использованных сокращений.

АОТ −аэрозоль ОТ, или натриевая соль ди-(2-этил)гексилового эфира   сульфоянтарной кислоты,

ГПК −гидроперекись кумила,

ИФА – иммуноферментный анализ,

Миоглобин—RSH −комплекс миоглобина с меркаптоэтанолом,

МТОАХ −метилтриоктиламмоний хлорид,

ПАВ −поверхностно-активное вещество,

ПХ −пероксидаза хрена,

ФИ –фосфатидилинозит,

ФХ –фосфатидилхолин,

ФЭА –фосфатидилэтаноламин,

ЦТАБ −цетилтриметиламмоний бромид,

ЭДТА –этилендиаминтетрауксусная кислота,

E –фермент,

I –интенсивность,

к −константа скорости ферментативной реакции первого порядка,

к_кат − каталитическая константа скорости реакции,

к_m,каж −кажущаяся величина константы Михаэлиса,

n −соотношением [H₂O]/[ПАВ],

θ −молярная эллиптичность.

Введение.

 

Роль мембран в биохимических реакциях многообразна и до сих пор не выяснена во всех деталях. В настоящее время нельзя с полной определенностью судить о взаимном влиянии мембранных компонентов, их структурной организации, а также о липид-белковых взаимодействиях в биомембранах. Методы, применяемые для исследования структуры и функции мембран, трудно считать адекватными сложной задаче установления структурной организации ферментных комплексов в нативных биологических мембранах.

Как правило, сведения о липид-белковых и белок-белковых взаимодействиях получают на модельных системах различной степени сложности, которые имитируют определенные стороны биомембран, однако не всегда могут быть отождествлены с ними. Моделирование биомембран является важной частью современной мембранологии и интенсивно развивается в нескольких направлениях: 1) монослои липидов, 2) прямые мицеллы ПАВ в водной среде и обращенные мицеллы в органических растворителях, 3) обращенные мицеллы, включающие белки, 4) моноламеллярные липосомы (везикулы), 5) реконструированные в липидных дисперсиях и липосомах ферментные комплексы. Каждая из перечисленных модельных систем отражает определенную сторону биологических мембран, имеет свои преимущества и недостатки. В курсовой работе основное внимание уделено обращенным мицеллам ПАВ в углеводородах с включенными в них белками.

Преимущества обращенных мицелл ПАВ с солюбилизированным белком перед другими модельными системами заключаются в их простоте, термодинамической устойчивости и оптической прозрачности, что позволяет применять весь арсенал спектральных методов для изучения этих структур. Целесообразность исследования обращенных мицелл ПАВ, солюбилизировавших белки, диктуется также тем, что в природных мембранах имеются и играют важную роль неламеллярные структуры, построенные по типу обращенных мицелл. Доказано, что так называемые «липидные частицы», образованные по типу обращенных мицелл, реально существуют между монослоями биологических мембран.

В настоящее время хорошо известно, что около 30% мембранных липидов находятся в неламеллярном состоянии. В нативных мембранах ламеллофобными липидами являются, как правило, заряженные фосфолипиды. Неламеллярная фаза крайне необходима для встраивания мембранных белков в липосомы. Такие белки, как цитохром С, индуцируют образование фазы обращенных мицелл в ламеллярных структурах. Неламеллярная фаза в биомембранах индуцируется также введением в них холестерина.

Большим пробелом в изучении ультраструктуры биомембран и модельных систем было недостаточное понимание роли воды как структурного компонента реальных и модельных мембран. Общеизвестно, что гидратация фосфолипидов определяет физико-химические свойства и состояние компонентов биомембран. В основе регуляции структурных и функциональных свойств клеточных мембран лежит влияние воды на мембрану в целом и ее отдельные компоненты. Роль воды в функционировании биомембран особенно удобно исследовать и понять при изучении обращенных мицелл ПАВ в органической среде, которые легко включают воду внутрь своих полярных ядер. Причем количество воды в обращенных мицеллах можно дозировать с исключительной точностью. Водная среда обращенных мицелл ответственна за взаимодействие и устойчивость белков, находящихся в мицеллах, и за многие другие процессы.

Главной целью данной курсовой работы является  рассмотрение физико-химических свойств обращенных мицелл ПАВ с включенными в них ферментами, а также взаимного влияния обращенных мицелл и белков, включенных в них, анализ сходства и различия в поведении белков в мицеллах и в реальных биологических мембранах.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.УЛЬТРАСТРУКТУРА БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН.

 

Под ультраструктурой биомембран понимают взаимное расположение всех их компонентов в том или ином функциональном состоянии. Изучение ультраструктуры биомембран — огромная по масштабу и сложности проблема. Сложность задачи определяется большой гетерогенностью химического состава мембран и их структурной лабильностью [1, 2]. Считается, что основными компонентами биомембраны являются белки и липиды, соотношение которых меняется в широких пределах: от 4 в миелине до 4,5 в бактериальных мембранах.

     1.1.Белки.

Особенностью мембранно-связанных  белков является их плохая растворимость в воде и склонность к образованию агрегатов. В зависимости от прочности связи с мембраной белки можно разделить на периферические и интегральные. Первые относительно слабо связаны с мембраной  за счет электростатических сил часто с участием ионов Са²⁺ или Mg²⁺ и относительно легко отделяются от нее в мягких условиях, например, при промывании буферными растворами с различными значениями pH или ионной силы, либо растворами, содержащими комплексообразующие вещества ЭДТА или ЭГТА [3]. Периферические белки отделяются от мембраны с минимальным количеством липидов, а часто без липидов вообще. Примером периферического белка может быть цитохром C митохондрий.

Интегральные белки весьма прочно связаны с мембраной и для их выделения необходимо сначала разрушить липидный бислой [3]. Как правило, их препараты содержат значительное количество липидов. После удаления липидов интегральные белки образуют крупные агрегаты, нерастворимые в полярных средах. Интегральные белки мало отличаются от периферических по аминокислотному составу, но значительно разнятся по своей аминокислотной последовательности. У периферических белков заряды кислых и основных аминокислотных остатков распределены равномерно по поверхности молекулы, а гидрофобные взаимодействия ограничены внутренними областями. На поверхности молекул  интегральных белков ионизированные остатки распределены неравномерно. Имеются обширные гидрофобные области, ответственные за агрегацию и образование липопротеиновых комплексов. Типичными интегральными белками являются компоненты микросомальных электронтранспортных цепей [4—7].

     1.2.Липиды.

В мембранах различают  нейтральные липиды, фосфолипиды и гликолипиды. Нейтральные липиды в основном представлены холестерином. Мембраны клеток млекопитающих содержат фосфолипиды всех классов, хотя преобладают ФХ и ФЭА. С химической точки зрения фосфолипид состоит из четырёх частей: глицерина, двух жирных кислот с длинной углеводородной цепью, фосфорной кислоты и особой для каждого фосфолипида группы, которая называется характеристической группой. К гликолипидам относят гликозиды жирных кислот, гликозилдиглицерины и различные гликосфинголипиды [1,2].

1.3.Молекулярная организация  биомембран.

Мембрана в состоянии покоя должна иметь структуру, обладающую минимальной свободной энергией. В таком случае необходимо, чтобы ее модель удовлетворяла следующим условиям [2, 8]: 1) белки и липиды должны располагаться в мембране так, чтобы максимальное число полярных групп соседствовало с водной фазой, 2) углеводородные цепи липидов и неполярные аминокислотные остатки белков должны быть максимально защищены от контакта с водой, 3) конформация белков должна обеспечивать образование максимального числа водородных связей между донорными и акцепторными группировками, не находящимися в контакте с водой.

Существует несколько  типов моделей биомембран. Модель Давсона—Даниэлли—Робертсона (рис.1) предполагает, что фосфолипиды образуют бимолекулярный слой, представляющий собой внутреннюю часть мембраны. Наружная и внутренняя поверхности этого бислоя покрыты мономолекулярным слоем белков. Белки и полярные головки липидов связаны силами электростатического взаимодействия. Молекулы липидов не контактируют с водой, а белки находятся в β-конформации [9].

Согласно модели Бенсона [10] (рис. 1), белки сохраняют глобулярную форму и погружены в мембрану. Липиды рассредоточены между белковыми глобулами так, что их углеводородные фрагменты находятся в контакте с гидрофобными участками белковых молекул, занимая пространство между складками полипептидной цепи. Полярные головки липидов находятся па поверхности мембраны и контактируют с водой.

В 1966 г. была предложена «мозаичная модель» [11—13]: липиды образуют бимолекулярный слой, в котором свободно «плавают» глобулярные интегральные белки (рис. 1).

Таким образом, липидные и белковые фрагменты составляют своеобразную мозаику. Углеводородные цепи липидов и часть неполярных аминокислотных остатков интегральных белков образуют внутреннюю часть мембраны, которая не контактирует с водой. Полярные головки липидов и несущие заряд аминокислотные остатки находятся главным образом на поверхности мембраны. Периферические белки взаимодействуют с мембраной за счет электростатических сил. Некоторые интегральные белки могут пронизывать мембрану насквозь или образовывать внутри ее комплексы, состоящие из нескольких субъединиц одного белка или из разных интегральных белков. Между субъединицами могут сохраняться узкие щели, заполненные водой.

 

а                                                              б

в

Рис.1.Модели биологических мембран: а—Давсона—Даниэлли—Робертсона; б—Бенсона; в— мозаичная.

 

Ни одна из приведенных моделей не удовлетворяет трем термодинамическим требованиям, приведенным выше. Модель Давсона—Даниэлли—Робертсона исключает гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и изолирует от воды полярные группы липидов. Модель Бенсона не оставляет места образованию внутри- и межмолекулярных водородных связей полипептидных цепей. В наибольшей степени соответствует требованию минимизации свободной энергии мозаичная модель, подкрепленная многочисленными физико-химическими данными [1, 2].

Многие виды ферментативной активности мембран зависят от липидного окружения, что характерно, например, для цитохром Р-450 зависимых реакций в микросомальной системе [6,7,14]. С другой стороны, имеются данные о том, что изменение физического состояния липидных цепей мало сказывается на состоянии интегральных белков. Мозаичная модель удовлетворительно разрешает это кажущееся противоречие, предполагая различные типы связывания липидов с белками в мембране. Часть липидов образует бимолекулярный слой, в то время как другая часть непосредственно взаимодействует с белками, иммобилизуясь на их поверхности. Такая концепция подтверждается различной способностью липидов к экстракции из мембраны. Существуют «сильно»- и «слабосвязанные» липиды. Мозаичная модель помогает интерпретировать мозаикоподобное изображение биомембран, которое получают при их электронной микроскопии методом замораживания — травления. Метод, получивший название замораживание — скалывание, и его модификация, известная как замораживание — травление, основаны на раскалывании быстро замороженных препаратов мембран по их гидрофобной области (рис. 2) . На электронных микрофотографиях поверхность скола многих мембран выглядела как гладкий матрикс, испещренный большим количеством нерегулярно расположенных внутримембранных частиц. Хотя электронная микроскопия не давала возможности химически идентифицировать эти характерные структурные образования, однако косвенные данные говорили о том, что внутримембранные частицы имеют белковую природу[3].

Динамическая структура липидных бимолекулярных слоев природных мембран и их моделей детально изучена с использованием мощного арсенала физико-химических методов.

 

Рис.2. Раскалывание мембраны по методу замораживания — скалывания.

 

 

Так изучение методами ЭПР и ЯМР взаимодействия липидов с белками в реконструированных липид-белковых системах показало, что между ними реально существуют три типа взаимодействий [1,2, 15, 16]: 1) электростатическое, 2) гидрофобное, отвечающее за упорядоченность всего бислоя, 3) иммобилизация части липидов на белке без изменения фазового состояния всего остального липидного фонда.

Таким образом, физико-химические данные, полученные при изучении природных и искусственных мембран, в целом согласуются с мозаичной моделью.

Рис.3. Модель Штиера.

 

Однако Штиер и сотр. [17—19] методом спектроскопии ³¹Р-ЯМР на микросомах печени показали, что часть липидов, особенно ФЭА, присутствует в мембране в форме обращенных мицелл, которые совершенно необходимы для внедрения в нее интегральных белков. Такие структуры, построены из блоков, включающих не только бислойные участки, но и нарушенный бислой, содержащий между монослоями фазу обращенных мицелл, солюбилизировавших гидрофобный мембранный белок (рис.3), играют важную роль в функционировании цитохрома Р-450 и других мембранных белков.

Наличие неламеллярных участков в нативных мембранах[20] , инициирование образования обращенных мицелл некоторыми белками в модельных мембранах[21] , участие фазы обращенных мицелл в трансмембранном транспорте белков[22] указывают на важную роль обращенных мицелл и подобных им структур в строении и функционировании природных и модельных мембран. Перечисленные факты достаточно убедительны, чтобы обосновать необходимость изучения обращенных мицелл в органических средах в качестве моделей биологических мембран в надежде получить реальную картину функционирования белков и ферментов.

    2. ОБРАЩЕННЫЕ МИЦЕЛЛЫ ПАВ В ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ И ИХ СВОЙСТВА.

 

Липиды - амфифильные вещества, плохо растворимые как в полярных, так и в неполярных растворителях. Самым энергетически выгодным состоянием является мономолекулярный слой на границе раздела между полярной и неполярной средой. Мицеллами называются небольшие агрегаты липидов сферической, эллипсоидной или цилиндрической формы. Характер мицеллообразования определяется природой растворителя и свойствами ПАВ. В воде и ее смесях с полярными соединениями углеводородные цепи сконденсированы внутри мицеллы, в то время как полярные фрагменты взаимодействуют с водой. В неполярных органических растворителях образуются обращенные мицеллы, у которых полярные фрагменты обращены внутрь и могут включать воду и другие полярные компоненты, а углеводородные остатки находятся в гидрофобном растворителе (рис. 4) [3].