Контрольная работа по «Биофизическая химия »

 

благодаря их амфотерным свойствам, направление и скорость смещения во многом зависит от рН среды, в которой происходит миграция. Заряд различных белков в растворах с одинаковым рН зависит от аминокислотного состава, так как диссоциация белковых цепей приводит к образованию групп, имеющих положительный или отрицательный заряд. Под влиянием сил электрического поля компоненты разгоняемой системы распределяются согласно их заряду, приобретая соответствующую скорость движения, т.е. происходит электрофоретическое разделение. При этом во время электрофореза, наряду с разделением частиц согласно их зарядам, вступает в силу так называемый "молекулярно ситовой эффект", когда гелевая структура ведет себя по отношению к ионам как фильтр. Ионы, превышающие ее пористость, не проходят или проходят очень медленно, а более мелкие ионы быстрее проникают через поры медиума. Таким образом, скорость передвижения зависит не только от заряда иона, но и от величины пор геля, формы пор, величины движущихся ионов, взаимодействия между матрицей геля и движущимися ионами (адсорбция и др.)

Белки одного размера ведут  себя сходным образом, поскольку, во-первых, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, во-вторых, они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый негативный заряд. Крупные белки, обладающие большим зарядом, подвергаются действию значительных электрических сил, а также более существенному торможению. В обычных растворах эти эффекты, как правило, взаимно погашаются, но в порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие молекулы тормозятся значительно сильнее, чем малые, поэтому оказываются ближе к стартовой линии. Смесь молекул делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой. Выявить эти полосы можно путем окрашивания соответствующим красителем.

 

5 Абсорбционная спектроскопия. Принцип метода. Применение метода в исследовании биомакромолекул и биопрепаратов.

 

Спектроскопия — это исследование взаимодействия света с веществом. У этого взаимодействия есть два  различных аспекта, которые могут  быть использованы для изучения атомов и молекул. Во-первых, можно определять длины волн, которые взаимодействуют  с атомами и молекулами (качественный анализ). Во-вторых, можно измерять количества света, поглощенного или излученного  на какой-либо определенной длине волны (количественный анализ). В обоих  случаях требуется выделять из излучения  источника отдельные длины волн, поэтому главным этапом любого спектроскопического  измерения является разложение света  в спектр. В каждом из двух случаев  есть два пути проведения наблюдений: можно регистрировать свет, который  поглощается атомами и молекулами, или свет, который испускается. В  итоге мы имеем четыре разных вида спектроскопии: абсорбционную и  эмиссионную, каждая из которых может  быть качественной или количественной. Спектральный анализ давно применяется в химии и материаловедении для определения следовых количеств элементов. Методы спектрального анализа стандартизованы, информация о характерных линиях большинства элементов и многих молекул хранится в компьютерных базах данных, что в значительной мере ускоряет анализ и идентификацию химических веществ.

Абсорбционная спектроскопия  — это изучение света, поглощенного молекулами. Абсорбционный метод  основан на измерении  ослабления мощности (интенсивности)  потока  излучения  при прохождении его через поглощающую среду. При прохождении монохроматического (одной длины волны)  излучения  через  раствор  поток  излучения  ослабляется  в  связи  с поглощением энергии частицами данного вещества (рис. 8). 

                                            

Рис. 8. Ослабление  излучения I0  раствором  с  концентрацией  «с» поглощающего вещества и толщиной слоя «ι»:  I <  I₀.

 

Понижение интенсивности  подчиняется объединённому закону Бугера-Ламберта-Бера,  согласно  которому  интенсивность излучения при прохождении через вещество  уменьшается в степенной зависимости от концентрации «c» и величины слоя вещества «ι»:       

                         , т.е.          или  

где I₀- интенсивность падающего излучения,

I- интенсивность прошедшего  излучения, 

ε- молярный  коэффициент  поглощения,  характерный  для  данного вещества, зависит от длины  волны,  температуры, давления.

Результаты измерения выражают либо как процент пропускания T_%, либо, гораздо чаще, как поглощение А или оптическая плотность D (иногда OD_l). Эти величины задаются выражениями:

                              ; 

Оптической плотностью удобно пользоваться, так как при d = 1 см она равняется e´с. В некоторых случаях, если с велико, e становится функцией с, и тогда можно сказать, что закон Ламберта-Бера нарушается. Это может быть результатом рассеяния света или структурных изменений (например, димеризации, агрегации или химических изменений) при высоких концентрациях (рис. 9).

Рис. 9. Положительное и отрицательное  отклонение от закона Ламберта-Бера и  причина отклонений.

а – сдвиг спектра, связанный с возрастанием концентрации, часто в результате агрегации. При длине волны l₂ не наблюдается изменение e при изменении концентрации (изобестическая точка).

б – кривая, показывающая отклонение от закона Ламберта-Бера: при l₁ отклонение положительное (1), при l₃ – отрицательное (2), в изобестической точке l₂ закон всегда соблюдается (3).

Измерение поглощения осуществляют с помощью спектрофотометра. При описании биохимических образцов почти всегда имеются в виду растворы этих образцов. Несмотря на различия в конструкции, все спектрофотометры состоят из источника света, монохроматора (для выделения определенной длины волны), прозрачной кюветы, куда помещается образец, детектора света (как правило, состоящего из фотоэлектронного умножителя ФЭУ) и системы вывода данных (компьютер, дисплей, реже – самописец) для регистрации выходного сигнала детектора (рис. 10).

Ход работы обычно следующий: измеряют при одной длине  волны интенсивность света, прошедшего через кювету сравнения, наполненную растворителем, в котором приготовлен образец, (например, буфер или вода), затем следует измерение интенсивности света, прошедшего через раствор изучаемого вещества в том же растворителе. Далее фиксируется изменение в интенсивности света, по которому можно судить о поглощении растворенного вещества. Для получения спектра эта операция повторяется при многих длинах волн. Некоторые приборы, называемые автоматическими двухлучевыми регистрирующими спектрофотометрами, позволяют осуществлять развертку длин волн и одновременно измерять поглощение образца и растворителя (которые находятся в различных кюветах) и фиксировать с помощью электронного оборудования суммированный поток излучений.

Рис. 10. Принципиальная схема устройства спектрофотометра.

 

Свет от лампы 1 проходит сквозь монохроматор 2 для выделения пучка света с определенной длиной волны. Монохроматичный свет проходит сквозь кювету с образцом 3 или растворителем 4, помещенные в держатель для кювет 5,  затем попадает на регистрирующее устройство (ФЭУ) 6, сигнал с которого передается измерительному прибору 7.

На рис. 11 показаны спектры, снятые в видимой и УФ-областях для двух биологических молекул. Обычно определяют величины D или e. Длина волны, соответствующая максимуму поглощения, называется l_макс, и именно при этой длине волны обычно определяют e.

Рис. 11. Сравнение спектров поглощения двух биологических молекул: флавинмононуклеотида (а) и фикоцианина (б). Спектры можно использовать для идентификации соединения.

 

Некоторые полосы поглощения состоят из многочисленных пиков, и часто регистрируют длины  волн, соответствующие пикам, имеющим меньшие молярные коэффициенты поглощения. Эти длины волн иногда также называют l_макс или указывают, что вещество имеет максимумы поглощения при l₁ , l₂ , l₃, ... l_n. Иногда измеряют ширину полосы, хотя и не обязательно.

Спектроскопия открыла широкие  возможности для получения информации фундаментального характера во многих областях науки. При изучении биологических молекул измеряются их спектры поглощения и флуоресценция. Измерение поглощения проводится для многих целей: определения концентрации вещества, анализа некоторых химических реакций, идентификации веществ и определения структурных параметров макромолекул.

Пример А. Измерение концентрации. Наиболее часто измерения поглощения проводят для определения концентрации. Это можно делать, если известен коэффициент молярной экстинкции и соблюдается закон Ламберта-Бера.

Пример Б. Исследование химических реакций. Для использования спектрофотометрии необходимо, чтобы в ходе реакции изменялось поглощение одного из реагентов.

Пример В. Идентификация веществ путем спектральных измерений. Большинство веществ имеют характерные спектры поглощения и могут быть идентифицированы с их помощью. Для этого измеряют полный спектр либо отношение поглощений при различных длинах волн.

Пример Г. Переход спираль — клубок в двухцепочечной ДНК: денатурация и ренатурация. D₂₆₀ ДНК возрастает, если ДНК нагревается в определенном интервале температур (рис. 12).

                                       

Рис. 12. Зависимость оптической плотности трех растворов ДНК от температуры. а - ДНК E. coli (50% G-C) в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,8; б – то же в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,8; в – ДНК Pseudomonos aeroginosa (68% G-C) в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,8.

 

Эта так называемая гиперхромия является критерием денатурации или перехода спираль — клубок. Таким образом, с помощью простого оптического метода удается определить устойчивость ДНК к воздействию температуры, рН, ионной силы, к добавлению малых молекул, варьированию полярных и неполярных растворителей. Этот метод явился мощным средством установления некоторых важнейших свойств ДНК.

Пример Д. Спектрофотометрическое титрование белков. При многих исследованиях структуры белков возникает необходимость определения величины рК диссоциации протонов ионизуемых боковых групп аминокислот, поскольку эти величины указывают на локализацию аминокислоты в белке. Это часто можно сделать спектрофотометрически, так как при диссоциации зачастую меняется спектр одного из хромофоров.

Пример Е. Переход спираль — клубок в белках (денатурация). Так как в процессе денатурации спрятанный хромофор становится доступным растворителю, контролируя поглощение этих хромофоров, можно наблюдать переход спираль — клубок в белках.

Пример Ж. Обнаружение связывания с белками малых молекул. Связывание субстрата с активным центром фермента оказывает влияние на полярность этого района или на доступность его растворителю и часто вызывает изменение спектров хромофоров, находящихся в активном центре или недалеко от него. Сравнивая наблюдаемые изменения с изменениями, происходящими при пертурбации растворителем, можно получить информацию о структуре активного центра.

Пример З. Ассоциация белка. Изменения спектров в процессе ассоциации белка могут быть вызваны следующими причинами: либо хромофоры, находившиеся на поверхности, попали в участок связывания и стали недоступны растворителю, либо произошла конформационная перестройка, в результате которой хромофор стал недоступным или доступным, но в другой части молекулы.

 

 

 

6. Максимум поглощения света. Свет какой длины волн поглощают:

- молекулы ДНК;

- молекулы белков.

Максимум поглощения ДНК 260 нм.

                                         

Рис.   13.  Структурная формула   гема   (а),   структурные формулы активного   центра   окси-   (б)   и дезоксигемоглобина (в)  и спектры поглощения окси- и дезоксигемоглобина.

 

Маленькие не полимерные молекулы поглощают в   ближнем   (300-400   нм),   дальнем   (200-300   нм)   и   в   вакуумном   (<200   нм) ультрафиолетовом   диапазоне.  На рис. 13 представлена структурная формула хромофорной группы белка гемоглобина (гема) и спектры поглощения гемоглобина и оксигемоглобина. Из рисунка видно, что связывание Fe(II) с молекулой кислорода (связь нековалентная) приводит к характерным изменениям спектра поглощения: коротковолновый максимум смещается в еще более коротковолновую область,   а   в   длинноволновой области  видимого   диапазона   вместо одного максимума (555 нм) появляется два (540 и 576 нм). Характерные особенности спектров   поглощения   гемоглобина   и   оксигемоглобина   широко   используются   для   количественной оценки степени насыщения гемоглобина кислородом.

 

 

 

 

7 Спектр кругового дихроизма белков  АВА-1 и RS. Какова вторичная структура данных белков?

 

Белки, как  практически все биологические  молекулы, вследствие своей пространственной асимметрии обладают оптической активностью. При прохождении через оптически  активную среду плоскополяризованный свет становится эллиптически поляризованным. Эллиптичность света q является одной из мер оптической активности. Она определяется как арктангенс отношения малой и большой осей эллипса. Другим параметром, характеризующим оптическую активность, является отклонение большой оси эллипса от направления поляризации падающего света, называемое оптическим вращением (или дисперсией оптического вращения) j.

Если представить  плоскополяризованную волну Е в виде суммы двух волн противоположной круговой поляризации Е=Е_L+Е_R, то можно показать, что величина j пропорциональна разности показателей преломления среды для этих волн n_L-n_R, а величина q - разности коэффициентов экстинции e_L-e_R. Таким образом, оптическое вращение и появление эллиптической поляризации у плоскополяризованного света при прохождении его через оптически активную среду можно объяснить различным замедлением (n_L¹n_R) и поглощением (e_L¹e_R) двух его составляющих Е_L и Е_R, поляризованных по кругу. Разность Dn=n_L-n_R называют круговым двулучепреломлением, а разность De=e_L-e_R - круговым дихроизмом. Зависимости этих величин от длины волны называют спектрами дисперсии оптического вращения (ДОВ) и кругового дихроизма (КД).